Modificaciones técnicas en el uso de microsatélites y AFLP para el estudio poblacional de diversas especies de peces en el río Sinú, Colombia

Modified techniques used for microsatellite and AFLP for the population study of divers species at the Sinu river fish, Colombia

En Colombia se han realizado pocos estudios de conservación genética aplicando técnicas de biología molecular. Debido a la compleji­dad del proceso de estandarización de las técnicas de laboratorio se presentan los protocolos y las modificaciones realizadas durante el estudio genético de cuatro especies ícticas del río Sinú, con el fin de que sean útiles como guía para futuros estudios, no sólo para peces sino para otras especies. Se realizaron modificaciones de los protocolos originales en la extracción de ADN, la cual fue llevada a cabo con un kit comercial, en las reacciones de PCR para la obtención de marcadores microsatélites y AFLP, así como en la genotipif icación de alelos. Las variaciones realizadas fueron distintas para cada una de las especies trabajadas. Palabras clave: extracción ADN; biología molecular; genotipificación; ictiología; DNA extraction; molecular biology; genotypification; ichthyology.

Few genetic conservation studies carried out in Colombia have applied molecular biology techniques. Protocols and modifications arising from the genetic study of four fish species from the Sinú river basin are presented as guidelines for future work in this field (and with other species) as laboratory standardisation processes are complex. The original commercial kit's DNA extraction protocols were modified as were those for PCR reactions for obtaining micro-satellite markers and AFLPs, as well as allele genotypification. Particular variations were made f or each of the species studied. Key words: DNA extraction; molecular biology; genotypification; ichthyology.

	Modificaciones técnicas en el uso de microsatélites y AFLP para el estudio poblacional de diversas especies de peces en el río Sinú, Colombia Modified techniques used for microsatellite and AFLP for the population study of divers species at the Sinu river fish, Colombia Natalia Lamprea*, Liliana López*, Diana Santacruz*, Jimena Guerrero**, Consuelo Burbano***
	RESUMEN En Colombia se han realizado pocos estudios de conservación genética aplicando técnicas de biología molecular. Debido a la compleji­dad del proceso de estandarización de las técnicas de laboratorio se presentan los protocolos y las modificaciones realizadas durante el estudio genético de cuatro especies ícticas del río Sinú, con el fin de que sean útiles como guía para futuros estudios, no sólo para peces sino para otras especies. Se realizaron modificaciones de los protocolos originales en la extracción de ADN, la cual fue llevada a cabo con un kit comercial, en las reacciones de PCR para la obtención de marcadores microsatélites y AFLP, así como en la genotipif icación de alelos. Las variaciones realizadas fueron distintas para cada una de las especies trabajadas. Palabras clave: extracción ADN, biología molecular, genotipificación, ictiología. ABSTRACT Few genetic conservation studies carried out in Colombia have applied molecular biology techniques. Protocols and modifications arising from the genetic study of four fish species from the Sinú river basin are presented as guidelines for future work in this field (and with other species) as laboratory standardisation processes are complex. The original commercial kit's DNA extraction protocols were modified as were those for PCR reactions for obtaining micro-satellite markers and AFLPs, as well as allele genotypification. Particular variations were made f or each of the species studied. Key words: DNA extraction, molecular biology, genotypification, ichthyology.
	INTRODUCCIÓN El uso de técnicas moleculares ha permitido eva­luar varios aspectos genéticos de las especies sil­vestres, algunas en peligro de extinción, como la variación genética de poblaciones disminuidas demográficamente, la existencia de flujo génico en­tre poblaciones, la estructura genética y la definición de unidades genéticas para conservación (Smith y Wayne, 1996).	Con este objetivo se han utilizado marcadores genéticos como el ADN mitocondrial, los loci isoenzimáticos (Queller et al., 1993), los microsatélites o repeticiones cortas en tándem (STR) (Estoup et al., 1998), los polimorfismos de amplificación al azar (RAPD), de longitud (AFLP) y de restricción (RFLP) (Vos et al., 1995).
	Biólogas. Universidad Nacional de Colombia. Correo electrónico: lamprea@telesat.com.co, diana_santacruz@yahoo.com, lililokl@yahoo.com Bióloga Pontificia Universidad Javeriana, M. Sc. Genética. Correo electrónico: cguer@tutopia.com Profesora asistente. Universidad Nacional de Colombia, M. Sc. Genética. Correo electrónico: cburbano@ciencias.unal.edu.co. Direc­ción postal: Departamento de Biología, Universidad Nacional de Colombia. Ciudad Universitaria. Bogotá. A.A. 14490. Recibido: enero 22 de 2004. Aceptado: mayo 21 de 2004.
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	Los microsatélites son secuencias de repeti­ción en tándem de 1 a 6 pares de bases. Han demos­trado ser útiles dadas sus características como alto polimorfismo y amplia distribución en el genoma de todos los organismos. En general son selectivamente neutros y de relativo fácil manejo en el laboratorio (Goldstein y Pollock, 1997). Los marcadores AFLP, por su parte, se basan en polimorfismos de longitud de fragmentos amplifi­cados por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (AFLP-PCR). Además de ser marcadores codominantes, no dependen de los estados alélicos ni de la expresión génica (Mueller y Wolfenbarger, 1999). La aplicación de la biología molecular en es­pecies silvestres poco trabajadas presenta varias complicaciones puesto que no existen protocolos estandarizados para trabajar tipo de muestras como músculo agalla alevino, etc.; no hay cebadores es­pecíficos diseñados para estas especies y es poco el intervalo de posibilidades para escogerlos; si las especies son escasas en medio silvestre no se pue­den usar técnicas invasivas. Esto implica que la ma­yoría de estos estudios requieran un largo tiempo de estandarización en las técnicas de laboratorio. En Co­lombia han sido muy escasos los estudios de diver­sidad genética de especies endémicas, especialmen­te en peces (Bejarano, 2001; Castiblanco, 2003), por lo que es de gran importancia divulgar el procedi­miento de estandarización ya que puede ser útil como protocolo de trabajo en futuros estudios de conser­vación genética para otras especies silvestres. A continuación se presentan las modificaciones realizadas para la extracción de ADN a partir de teji­do de Caquetaia krausii (mojarra amarilla), Brycon moorei sinuensis (dorada), Prochilodus magdalenae (bocachico) y Sorubim cuspicaudus (bagre blanco), usando un kit comercial. En cuanto a la aplicación de marcadores moleculares se presentan los protoco­los utilizados para la obtención de marcadores microsatélites en C. krausii, B. moorei sinuensis y P. magdalenae por medio de amplificación cruzada, ya que aún no se han desarrollado cebadores específi­cos para estas especies, y para la obtención de mar­cadores AFLP en S. cuspicaudus.	MATERIALES Y MÉTODOS Extracción de ADN Colección y preservación del tejido. La colección de las muestras se realizó en distintas localidades de la cuenca del río Sinú así como en estaciones piscícolas de la zona, tomando un trozo de tejido muscular o de branquia. En algunas de las estacio­nes piscícolas se colectaron alevinos. Todas las muestras se preservaron en etanol al 96%. A su lle­gada al laboratorio se realizó un recambio de etanol y se almacenaron a 4 °C. Extracción. La extracción se realizó utilizando el kit (Wizard Genomics DNA Purification kit) de Promega®, el cual trabaja con tres soluciones principales: una solución SDS-hipotónica para lisis nuclear, RNAsa para degradar ARN y solución precipitadora de proteínas. El ADN es precipitado usando isopropanol (Promega, 1996). Se siguió el protocolo para tejido animal de hí­gado de ratón en las muestras de B. moorei sinuensis, P. magdalenae y S. cuspicaudus, mientras que para C. kraussii se siguió el protocolo para tejido de cola de ratón, debido a que éste reduce los residuos de pro­teína que se producen al usar el protocolo para tejido animal de hígado y que afectan la calidad del ADN en esta especie. En general, el cambio más importante se reali­zó en el paso de maceración y en la cantidad de teji­do empleado. Para las muestras de músculo se utili­zaron aproximadamente 0.3 cm3 de tejido. Para el tejido de branquias se trabajó con cuatro filamentos de éstas y para los alevinos, con el tercio posterior del animal (tabla 1). C. kraussii es la única especie que requiere un pretratamiento del tejido donde se adiciona EDTA y proteinasa K junto con la solución de lisis nuclear, en el primer paso del protocolo, al igual que se incre­menta el tiempo de incubación de esta mezcla; mien­tras que el tejido muscular de S. cuspicaudus re­quiere maceración con nitrógeno líquido para disgregar el tejido (tabla 1). La calidad del ADN se verificó mediante geles de agarosa al 0.8%, en cámara de electroforesis ho­rizontal a 80V durante 30 minutos, con tinción de bromuro de etidio. Una banda nítida indica una ex-
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	Tabla 1. Protocolo de extracción de ADN incluyendo las modificaciones realizadas para cada especie Paso Protocolo original Modificación C.kraussii B. moorei sinuensis P.magdalenae S.cuspicaudus 1 500 |iL solución de lisis nuclear + 120 ni EDTA 0.5M (pH 8.0) 100 fiL EDTA 0.5M 500 |iL sol. Nuclei Lysis 300 |iL sol. Nuclei Lysis 600 |iL sol. Nuclei Lysis 2 0.5-1 cm3 de tejido y macerar 0.3 cm3 tejido 0.3 cm3 tejido 3.5 cm3 tejido 250 |iL Nuclei Lysis 0.2 cm tejido Nitró­geno líquido, ma­cerar 3 17,5 |iL de Proteinasa K (20mg/mL) 24 |iL proteinasa K No aplica No aplica No aplica 4 Incubar toda la noche a 55 °C. Agitar cons­tantemente Incubación 14 h a 55 °C. No agitar Incubar a 65 °C por 45 min Incubar a 64 °C por 30 min Incubar a 65 °C por 30 min 5 3 fiL de sol. RNAsa y mezcla por inversión. In­cubar la 15-30 min a 37 °C. Enfriar 5 min a tem­peratura ambiente 3 nL RNAsa, incubar a 37 °C por 40 min 2,7 nL RNAsa. Incubara 37 °C por 45 min 2.8 nL RNAsa Incubar a 37 °C por 30 min 3 nL RNAsa. Incubar a 37 °C por 30 min 6 200 fiL de sol. Precipitadora de proteínas. Vortex + hielo 5 min Protocolo original Protocolo original Hielo 8 mln Protocolo original 7 Centrifugar 4 min a 13000-16000 rpm Protocolo original Protocolo original Protocolo original Protocolo original 8 Sobrenadante a tubo con 600 |il_ isopropanol 20 °C Isopropanol 4 °C Isopropanol 4 °C 450 nL de sobrenadante Isopropanol 4°C 300-400 |iL de sobrenadante 9 Mezcla por inversión Protocolo original Protocolo original Protocolo original Protocolo original 10 Centrifugar 1 min a 13000-16000 rpm. Decantar sobrenadante Protocolo original Protocolo original Protocolo original Protocolo original 11 600 fiL etanol 70% + lavado por inversión Centrifugar 1 min a 13000-16000 rpm Protocolo original Protocolo original Centrifugar 1,5 min a 14000 rpm Protocolo original 12 Aspirar etanol Protocolo original Decantar Decantar Protocolo original 13 Invertir el tubo en pa­pel absorbente y de­jar secar 10-15 min Secar en cáma­ra de extracción gases Protocolo original 45 mln Protocolo original 14 Resuspensión en 100 |iL solución rehidratadora in­cubando toda la noche a 4 °C Protocolo original Protocolo original Protocolo original Protocolo original 15 Almacenar ADN a una temperatura de 2-8 °C Protocolo original Protocolo original Protocolo original Protocolo original
	tracción positiva (figura 1). La eficiencia del proceso de extracción fue similar en las especies trabajadas (94 a 96%). Posteriormente se procedió a realizar la amplificación de segmentos de ADN por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).	Aplicación de marcadores microsatélites Amplificación en Caquetaia kraussii. Se probaron 12 parejas de cebadores de la especie Oreochromis niloticus, correspondientes a los loci: UNH106, UNH109,
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	UNH123, UNH129, UNH132, UNH174,UNH189, UNH191, UNH192, UNH209, UNH216, UNH231, se­leccionados por poseer regiones repetitivas de dinucleótidos y temperaturas de alineamiento altas para la amplificación en O. Niloticus (Kocher, 1997).	1.20 min. de alineamiento a 47-54 °C, 1.20 min de extensión a 68 o 72 °C y extensión final a 68 o 72 °C por 3 min. Los productos amplificados fueron almacena­dos a -20 °C. Las amplificaciones se verificaron por medio de electroforesis en geles de agarosa 3% te­ñidos con bromuro de etidio a 70 V por 50 minutos en cámara de electroforesis horizontal. De las doce parejas de cebadores probadas, seis amplificaron positivamente en C. kraussii (tabla 2). Amplificación en Prochilodus magdalenae y Brycon moorei sinuensis. Se utilizaron primers de­sarrollados para una especie relacionada, Piaractus mesopotamicus (Calcagnotto et al., 2001). Como con­trol positivo se utilizó ADN de un individuo de la espe­cie Piaractus brachypomus en la cual la eficacia de los primers fue evaluada por los mismos autores. Cada reacción de PCR se realizó en un volu­men total de 12.5 \iL con: 2.0 ^L de ADN, 10 mM de Buffer B de amplificación (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 1 % de Triton), 2.5mM de MgCl2 (excepto para el bocachico en el locus Pme20 donde se usaron 2.0 mM), 200 \iM de solución de dNTP, 0.8 ^M de solu­ción de cada primer y 0.5 U de Taq polimerasa. Las condiciones de la reacción se realizaron de la siguien­te manera: desnaturalización inicial del ADN a 95 °C por 4 min, 30 a 40 ciclos con 30 segundos de desnaturalización a 95 °C, 30 segundos de alinea­miento a 44-57 °C y 30 segundos de extensión a 68- 72 °C. Por último, una extensión a 68-72 °C por 10 min.
	Figura 1. Gel de Agarosa 0.8% donde se verifica la calidad y cantidad de ADN en C. kraussii. Flecha: banda de ADN.
	La estandarización de la amplificación se inició siguiendo el protocolo original de Kocher y colabora­dores (1998), utilizando como control positivo ADN de O. niloticus. Para lograr una amplificación exitosa en C. kraussii se realizaron cambios en la temperatura de alineamiento y la concentración de MgCl2 (tabla 2). La PCR se realizó en un volumen final de 25 ^L, con: 10mM de Buffer B de amplificación (100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 1% de Triton), 2.5-3.0 mM de MgCl2, 0.16 - 0.18 mM de dNTPs, 0.16 ^M de primer, 1.5 ^L de ADN y 0.5 U de Taq polimerasa. Las condiciones para la PCR fueron: 1 min inicial a 95 °C, seguido de 26 a 32 ciclos a 1 min de desnaturalización a 95 °C,
	Tabla 2. Loci amplificados en C. kraussii y condiciones específicas para PCR.
	Locus Motivo de repetición MgCl2 (mM) Tm y N° UNH106 (CT)13(CA)20 2.5 50 °Cx 26 ciclos UNH109 (CT)6(CA)9(CT)13(AT)7 2.6 49 °C x 5 ciclos 50 °C x 5 ciclos 51 °C x 8 ciclos 52 °C x 8 ciclos UNH132 (GA)6(GG)(GA)7GC(GA)5 2.5 51 °Cx 26 ciclos UNH191 UNH209 (AC)25 (AC)9 3.0 3.0 51 °C x 2 ciclos 52 °C x 5 ciclos 53 °Cx 10 ciclos 54 °Cx 15 ciclos 47 °Cx 32 ciclos UNH216 (AC)11 2.8 48 °Cx 28 ciclos		En el caso del P. magdalenae para los locus Pme5 y Pme14, fue necesario hacer los primeros tres ciclos con una temperatura de alineamiento baja: 45 °C para Pme5 y 44 °C para Pme14. Para el resto de ciclos (37) se usó una temperatura mayor (tabla 3). Los productos amplificados fueron verifi­cados con el mismo método que para C. kraussii. De los ocho cebadores desarrollados por Calcagnotto y colaboradores (2001) seis fueron exitosamente genotipificados para B. moorei sinuensis y cinco para P. magdalenae. Para el locus Pme28 en B. moorei sinuensis sólo se observaron bandas en regiones no correspon-
	Tm: temperatura de alineamiento; N°: número de ciclos para cada tempe­ratura de alineamiento.
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	Tabla 3. Loci de P. mesopotamicus amplificados en B. moorei sinuensis y P. magdalenae. Locus/ Acceso a GeneBank P. mesopotamicus B. moorei sinuensis P.magdalenae Motivo de repetición Tm Tm Text No. Ciclos Tm Text No. Ciclos Pme2 AF362445 (GT)18 55 48 68 40 0 0 0 Pme4 AF362446 (GT)14 59-51 45 68 40 0 0 0 Pme5 AF362447 (GA)10gggagctggta (GT)10C(GT)12 59-51 46 68 40 45-47 70 40 Pme14 AF362448 (CTG)7 59-51 46 68 40 44-46 70 40 Pme20 AF36449 (GT)15 57 47 72 40 50 72 30 Pme28 AF362451 (GT)15 57 0 0 0 57 72 35 Pme32 AF362452 (CTG)7 57 48 70 40 48 70 40 Tm: temperatura de alineamiento en °C. Text: temperatura de extensión en °C. Se observan las diferen­cias en temperatura y número de ciclos. ø: no fue posible amplificación.		cias de peso molecular de 50 bp y 10 bp en por lo menos un carril por gel, y la tinción se realizó en so­lución de bromuro de etidio de 5 mg/800 mL por 12 minutos (figura 3). La asignación de alelos se realizó con el programa Gene Tools (Hitachi Genetic Systems®), el cual permi­te cuantificar el tamaño molecular de cada banda con respecto al marcador de peso molecular utiliza­do (Hitachi, 1998). En general, el poli­morfismo de los loci am­plificados para C. kraussii
	dientes a los microsatélites. De manera similar, para los loci Pme2 y Pme4 en P. magdalenae se obtuvo una efectividad de amplificación muy baja, 39 y 29%, respectivamente. Por esta razón, los loci anteriormente mencionados no fueron tomados en cuenta. Genotipificación de microsatélites. Para las espe­cies C. kraussii, B. moorei sinuensis y P. magdalenae, la genotipificación se realizó en geles denaturantes de poliacrilamida 6% (acrilamida/bisacrilamida 29:1, 4.6M urea, TBE 1X) en cámara de electroforesis verti­cal, con 123 V durante 6 horas. Se utilizaron referen-	fue alto, encontrándose entre 10 y 24 alelos por loci con un tamaño similar al reportado para O. niloticus. La diferencia entre los alelos de mayor y menor tama­ño estuvo entre 20 y 45 pares de bases (tabla 4).
		Tabla 4. Intervalo de tamaño de los alelos para los loci microsatélites en O. niloticus y C. kraussii, No. de alelos y heterocigosidad esperada (He) en C. kraussii. Locus O. niloticus Caquetaia kraussii Tamaño (bp) Tamaño (bp) N° Alelos He UNH106 130 103-123 10 0.81 UNH109 183 141-187 24 0.93 UNH132 88 73-99 15 0.87 UNH191 173 133-158 15 0.87 UNH209 190 185-219 17 0.87 UNH216 125 102-136 15 0.83
		En todos los casos el intervalo de tamaño de los loci microsatélites encontrados en el bocachico y la dorada fue mayor al obtenido por Calcagnotto y colaboradores (2001) para Piractus mesopotamicus, aunque en la mayoría de los casos los rangos se sobrelapan. Se encontró también un alto polimorfismo para todos los loci analizados con un número de alelos por locus entre 5 y 17 (tabla 5).
	Figura 3. Gel denaturante de poliacrilamida 6% con tinción de bromuro de etidio para genotipificación de muestras de P. magdalenae para el locus Pme20. Carril 6: patrón de peso molecular de 50 bp. Carril 12: patrón de peso molecular de 10 bp. Las muestras se observan en un intervalo de 200 a 250 bp.
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	Tabla 5. Intervalo de tamaño, número de alelos y heterocigosidad esperada (He) para P. mesopotamicus, B. moorei sinuensis y P. magdalenae. Locus P. mesopotamicus B. moorei sinuensis P.magdalenae Intervalo (bp) N° Alelos He Intervalo (bp) N° Alelos He Intervalo (bp) N° Alelos He Pme2 195-213 10 0.85 158-184 13 0.71 - - - Pme4 191-213 7 0.70 179-197 9 0.63 - - - Pme5 182-200 8 0.80 200-218 9 0.76 184-210 14 0.87 Pme14 195-208 9 0.74 192-204 5 0.71 160-214 17 0.88 Pme20 213-215 2 0.37 203-215 6 0.68 192-212 11 0.85 Pme28 209-227 10 0.83 - - - 225-256 14 0.85 Pme32 242-247 3 0.30 193-205 5 0.57 221-257 13 0.80		lección mediante pre-amp primer mix en 20 ^L el cual contenía: buffer 10 x, Taq polimerasa, MgCl2 y DNA liga­do. Se realizaron 20 ciclos a 94 °C por 30 seg, 56 °C por 60 seg, 72 °C por 60 seg. Los productos se diluye­ron 1:50 (ADN ligado: buffer TE) y luego se verificaron en geles de agarosa al 0.8%; las bandas que se observan en este punto son más in­tensas que el ADN extraído, con un barrido continuo pero más definido que las digestiones, indicando una preamplificación exitosa.
	Aplicación de marcadores AFLP en Sorubim cuspicaudus La técnica de AFLP está basada en la amplificación de subgrupos de fragmentos de restricción genómicos usando PCR. El ADN se corta con enzimas de res­tricción y los adaptadores de doble cadena son liga­dos a la terminación de los fragmentos de ADN para generar el ADN molde utilizado en la amplificación. Las secuencias de los adaptadores y los sitios de restricción adyacentes sirven como lugares de unión para la posterior amplificación de los fragmentos de restricción (Vos et al., 1995). Para genomas complejos, como el de S. cuspicaudus, es necesario hacer una preamplificación y una amplificación con el fin de reducir el número de fragmentos, facilitando la lectura en los geles de poliacrilamida (Vos et al., 1995). El proceso de obtención de marcadores AFLP se realizó bajo el protocolo de AFLP Análisis System I y AFLP Starter primer kit de Life Technologies GIBCO BRL ® (GIBCO BRL, 1999). Digestión y ligación. Para las digestiones se mez­claron 2.5 ^L de buffer 5X, 2.5 ^L de DNA, 1 ^L de EcoRI/MseI, 6.5 ^L de agua destilada y se realizó una incubación a 70 °C por 15 min, la cual fue visualizada en geles de agarosa al 0.8% teñidos con bromuro de etidio. Posteriormente se mezclaron 9 [j,L del producto de digestión con 8,5 ^L de EcoRI/ MseI, 1 [j,L de T4 ligasa y se incubó la mezcla a 20 °C por 2 horas. El paso de preamplificación se realizó con una dilución 1:10 de esta mezcla. Preamplificación. Los productos de la ligación se preamplificaron con un primer de un nucleótido de se-
		Amplificaciones. A partir de las preamplificaciones se realizó una segunda amplificación con primers de tres nucleótidos de selección: 0.5 ^L de EcoRI (E-AGC) y 4.5 nL de MseI (M- CTG), 2.0 |iL buffer 10 x, 0.1 ^L Taq polimerasa con MgCl2, 7.9 ^L de agua destilada y 5 ^L de ADN digerido y preamplificado (dilución 1:50). La reacción se llevó a cabo en termociclador de la siguiente manera: 1 ciclo inicial a 94 °C de desnaturalización por 30 seg, 65 °C de ali­neamiento por 30 seg y 72 °C de extensión por 60 seg; posteriormente 12 ciclos bajando la temperatu­ra de alineamiento 5 °C entre un ciclo y el siguiente. Por último, 23 ciclos a 94 °C de desnaturalización por 30 seg, 56 °C de extensión por 30 seg y 72 °C de extensión por 60 seg. El producto de la amplificación se evidenció en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio mediante un barrido continuo. Genotipificación. La amplificación selectiva con tres nucleótidos de selección permitió obtener fragmen­tos más definidos en geles denaturantes de poliacrilamida al 6% (acrilamida:bisacrilamida 29:1, úrea 4,6M y TBE 1x). Los geles de poliacrilamida al 6% se corrieron en cámara de electroforesis vertical de 40 cm por 20 cm a 1800 V por 1 hora y fueron revelados con tinción de plata (Promega Silver Staining Kit ®). El tamaño aproximado de las bandas se estimó por comparación con un patrón de peso molecular de 100 pares de bases (pb). Este procedimiento per­mitió determinar 55 bandas polimórficas en un rango de 400 a 1000 pares de bases; las bandas de tama­ño menor o mayor a este rango fueron consideradas no significativas (figura 2).
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	REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL. VI No.1 Julio 2004 72 - 78
	UOOtpM	AGRADECIMIENTOS Las autoras agradecen a la empresa Urrá S.A. ESP por la financiación del proyecto Caracterización genética de cinco especies ícticas del río Sinú. Igual­mente expresan su agradecimiento al Departamento de Biología de la Universidad Nacional por permitir el uso del laboratorio de conservación genética. BIBLIOGRAFÍA Bejarano P., 2001. Estructura genética de las poblaciones ex situ de Crocodrylus intermedius (Graves, 1819) en Co­lombia, mediante marcadores AFLP. Bogotá: Colombia: Departamento de Biología. Universidad Nacional de Colombia. 152. Castiblanco J., 2003. Caracterización genética de dos pobla­ciones de Tilapia (Orechromis niloticus) en la cuenca del río Sinú. Bogotá, Colombia: Departamento de Biolo­gía. Universidad de los Andes. 180. Calcagnotto, D.; Russello. M.; Desalle, R. 2001. Isolation and characterization of microsatellite loci in Piaractus mesopotamicus and their applicablility in other Serrasalminae Fish. Molecular Ecology Notes. 1: 245-247. Estoup, A.; Rousset, F.; Michalakis, Y.; Cornuet, J. M.; Adriamanga, M.; Guyomard, R. 1998. Comparative analysis of microsatellite and allozyme markers: a case study investigating microgeographic differentiation in brown trout (Salmo trutta). Molecular Ecology. 7:339-353. Gibco, BRL. 1999. AFLP Analysis system I & AFLP starter pri­mer kit. Instruction Manual Life Technologies. Goldstein, D. B.; Pollock, D. D. 1997. Launching microsatellites: a review of mutation processes and methods of phylogenetic inference. Journal of Heredity. 88:335-342. Hitachi. 1998. Genetic systems. Gene tools users manual, Synoptics limited. Kocher, T. 1997. CA-Tilapia.html. http://tilapia.unh.edu/ WWWPages/TGP/CA-Tilapia.html. Provee vínculos a la base de datos del GeneBank, donde se depositaron las secuencias de cada locus y los primers que se diseña­ron para amplificarlos. Además, provee vínculos para información de loci aislados de Cíchlidos del lago Malawi. Revisado en marzo de 2003. Kocher, T.; Lee, W.; Soboloewska, H.; Penman, D.; Mcandrew, B. 1998. A genetic linkage map of a cichlid fish, the tilapia (Oreochromis niloticus). Genetics. 148: 1225-1232. Mueller, U.; Wolfenbarger, L. 1999. AFLP genotyping and fingerprinting. TREE. 14(10):389-394. Promega. 1996. Protocols and applications guide. Third Edition. Queller, C. R.; Strassman, I. E.; Hughes, C. R. 1993. Microsatellites and kindships. TREE. 8: 285-288. Smith, T.; Wayne, R. 1996. Molecular Genetic Approaches in Conservation. New York: Oxford University Press Inc. 332. Vos, P.; Hogers, R.; Bleeker, M.; Reijans, M.; Van, de Lee T.; Hornes, M.; Frijters, A.; Pot J.; Peleman, J.; Martin, K.; Zabeau, M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid Research. 25(21): 4407-4414.
	Figura 2. Gel denaturante de poliacrilamida (PAGE) al 6% con tinción de nitrato de plata revelando los productos amplificados de individuos de S. cuspicaudus. M: marcador de peso 1500-100 pb. CONCLUSIONES Se logró la estandarización para la extracción de DNA a partir de tejido muscular, de alevino y de branquia para las especies Caquetaia kraussii, Brycon moorei sinuensis, Prochilodus magdalenae y Sorubim cuspicaudus, utilizando un kit comercial (Wizard genomics de Promega®), con una efectividad pro­medio del 95%. El protocolo de los procedimientos realizados en laboratorio fue distinto para cada tejido utilizado y para cada especie. Por esta razón se presenta un protocolo diferente en cada caso. Con respecto a métodos de extracción clási­cos, éste aumenta la eficiencia y representa una ventaja en tiempo de extracción y en reducción de desechos en comparación con métodos basados en solventes orgánicos. El éxito de amplificación de los microsatélites fue variable para cada una de las especies evalua­das con estos marcadores, siendo de 50% (6 positi­vos de 12 cebadores probados) para C. kraussii, 75% (6 positivos de 8 cebadores probados) para B. moorei sinuensis y 63% para P. Magdalenae (5 positivos de 8 cebadores probados). La importancia del presente estudio radica en que fue posible aplicar técnicas moleculares al estu­dio genético de poblaciones de cuatro especies ícticas del río Sinú, lo cual permitió no sólo el análisis del estado genético actual de las poblaciones estudia­das, sino que se logró establecer una guía de trabajo de laboratorio para su uso futuro en trabajos de con­servación genética.
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