Caracterización molecular del germoplasma de ñame colombiano utilizando "DNA Amplificaron Fingerprinting (DAF)" en condiciones radiactivas

Molecular characterisation of Colombian yam germplasm by "DNA amplification fingerprinting (DAF)" in radioactivo conditions

Para la realización de este trabajo se utilizaron muestras de la colección de ñame (Dioscorea spp.) de la Universi­dad de Córdoba y algunas muestras provenientes del IITA (International Institute of Tropical Agriculture, Ibadan, Nigeria), con el fin de caracterizarlas molecularmente y complementar la información que se tiene de ellas. Dada la importancia del cultivo del ñame para los pequeños productores de la costa atlántica, surgió la propuesta de iniciar estudios moleculares en una primera etapa empleando técnicas como los AFLP En este trabajo, utilizan­do DNA amplificación "fingerprinting" (DAF), técnica basada en la PCR que utiliza oligos aleatorios que gene­ran patrones de bandeo característicos de cada individuo, se encontró que la diversidad de la población fue 0.0413 con una media de similaridad de 0.9587, lo cual indica que la colección de ñame existente en el país posee muy poca diversidad genética, y esto puede explicar parcialmente la vulnerabilidad del cultivo a plagas y enfer­medades, como sucedió a finales de la década de 1980 cuando la antracnosis prácticamente acabó con el cultivo en la costa atlántica colombiana. Es recomendable continuar con los estudios de caracterización utilizando una técnica de mayor poder de discriminación.

Samples from the Universidad de Córdoba's yam collection (Dioscorea spp.) and others originating from IITA (International Institute of Tropical Agriculture, Ibadan, Nigeria) were molecularly characterised to complement existing information about them. The yam (Diosocorea spp.) represents a basic crop for small-scale farmers on the Colombian Atlantic Coast who sow around 20,000 hectares per year. Even though they are dioecious species, only one sex is represented in Colombia; it must also be stated that climatic conditions are not propitious for its flowering. This situation has caused difficulty for work in yam breeding. The yam species and varieties used in the Colombian ABP (Agricultural Biotechnology Programme) have been molecularly characterised by AFLPs in a previous publication describing a preliminary study emerging from the need to broaden the characterisation of those accessions kept at the Universidad de Córdoba. Comparisons have also been done with some African accessions donated by IITA. In this article, samples were molecularly characterised by another fingerprinting technique, the DAF technique (DNA Amplification Fingerprinting) based on PCR, using random oligonucleotides for generating characteristic band patterns from each individual. The results showed 0.0413 population diversity with 0.9587 average similarity, indicating that the yam collection studied had very little genetic diversity and, probably, this could be why the crop is vulnerable to plagues and diseases, as happened at the end of the 1980s when anthracnose practically devastated the crop on the Colombian Atlantic coast. Similarity was also found between those Colombian and African samples analysed, agreeing with low diversity and less distance between common ancestors. The molecular results suggest the need for using other molecular techniques having a greater power of discrimination and also the need to broaden the genetic diversity in yam crops for providing greater sustainability for small-scale Colombian yam farmers.

	Caracterización molecular del germoplasma de ñame colombiano utilizando "DNA Amplificaron Fingerprinting (DAF)" en condiciones radiactivas Molecular characterisation of Colombian yam germplasm by "DNA amplification fingerprinting (DAF)" in radioactivo conditions Silvia L. Bustamante*, Mónica Guzmán* *, Gustavo Buitrago* ** RESUMEN Para la realización de este trabajo se utilizaron muestras de la colección de ñame (Dioscorea spp.) de la Universi­dad de Córdoba y algunas muestras provenientes del IITA (International Institute of Tropical Agriculture, Ibadan, Nigeria), con el fin de caracterizarlas molecularmente y complementar la información que se tiene de ellas. Dada la importancia del cultivo del ñame para los pequeños productores de la costa atlántica, surgió la propuesta de iniciar estudios moleculares en una primera etapa empleando técnicas como los AFLP En este trabajo, utilizan­do DNA amplificación "fingerprinting" (DAF), técnica basada en la PCR que utiliza oligos aleatorios que gene­ran patrones de bandeo característicos de cada individuo, se encontró que la diversidad de la población fue 0.0413 con una media de similaridad de 0.9587, lo cual indica que la colección de ñame existente en el país posee muy poca diversidad genética, y esto puede explicar parcialmente la vulnerabilidad del cultivo a plagas y enfer­medades, como sucedió a finales de la década de 1980 cuando la antracnosis prácticamente acabó con el cultivo en la costa atlántica colombiana. Es recomendable continuar con los estudios de caracterización utilizando una técnica de mayor poder de discriminación. Palabras clave: DAF, diversidad, Dioscorea spp, dendograma ABSTRACT Samples from the Universidad de Córdoba's yam collection (Dioscorea spp.) and others originating from IITA (International Institute of Tropical Agriculture, Ibadan, Nigeria) were molecularly characterised to complement existing information about them. The yam (Diosocorea spp.) represents a basic crop for small-scale farmers on the Colombian Atlantic Coast who sow around 20,000 hectares per year. Even though they are dioecious species, only one sex is represented in Colombia; it must also be stated that climatic conditions are not propitious for its flowering. This situation has caused difficulty for work in yam breeding. The yam species and varieties used in the Colombian ABP (Agricultural Biotechnology Programme) have been molecularly characterised by AFLPs in a previous publication describing a preliminary study emerging from the need to broaden the characterisation of those accessions kept at the Universidad de Córdoba. Comparisons have also been done with some African accessions donated by IITA. In this article, samples were molecularly characterised by another fingerprinting technique, the DAF technique (DNA Amplification Fingerprinting) based on PCR, using random oligonucleotides for generating characteristic band patterns from each individual. The results showed 0.0413 population diversity with 0.9587 average similarity, indicating that the yam collection studied had very little genetic diversity and, probably, this could be why the crop is vulnerable to plagues and diseases, as happened at the end of the 1980s when anthracnose practically devastated the crop on the Colombian Atlantic coast. Similarity was also found between those
	* Investigadora Instituto de Biotecnología, Laboratorio de Virus Vegetales, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. E- mail: slbustamanter@unal.edu.co ** Profesora Instituto de Biotecnología, Laboratorio de Virus Vegetales, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá. E-mail: mmguzmanb@unal.edu.co *** Profesor Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia. E-mail: gbuitragoh@unal.edu.co Recibido: Noviembre 20 de 2002. Aceptado: Junio 3 de 2003.
	57

	REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL V No.2 Diciembre 2003 57 - 63
	Colombian and African samples analysed, agreeing with low diversity and less distance between common ancestors. The molecular results suggest the need for using other molecular techniques having a greater power of discrimination and also the need to broaden the genetic diversity in yam crops for providing greater sustainability for small-scale Colombian yam farmers. Key words: DAF, diversity, Dioscorea spp, dendrogram
	INTRODUCCIÓN Bajo el nombre de ñame, Dioscorea spp, se conocen más de 600 especies caracterizadas por ser plantas primitivas, de hábito trepador y normalmente se pro­pagan en forma vegetativa (Ayensu, 1972). De las 600 especies pertenecientes al género Dioscorea, sólo 12 son utilizadas en comerciales, entre las cuales Dioscorea alata L. es la más distribuida en el mundo (Coursey, 1976b). En Colombia, Dioscorea rotundata también es utilizada por los productores de ñame. Esta especie, originaria del sudeste asiático, se cultiva en América y en Colombia desde la llegada de los prime­ros barcos españoles cargados de esclavos africanos; por tanto es normal encontrar este cultivo asociado a las culturas negras (IITA, 1993). En nuestro país el ñame ha sido un cultivo básico tradicional en pequeña y mediana escala de cultivadores de la costa atlántica para abastecer el consumo propio y el mercado local. En 1989 la producción se vio afectada por la antracnosis, enfermedad foliar causada por el hongo Colletotrichum gloesporiodes (Álvarez, 1991). A partir de 1992 se ha observado un incremento en las áreas sembradas y en el consumo per cápita (Ministerio de Agricultura, 2000). Se realizan exportaciones de algu­nos excedentes a Venezuela y Estados Unidos. Entre las estrategias para aumentar la produc­ción se debe contar con variedades seleccionadas que incrementen la sostenibilidad y el nivel de vida de los productores de ñame colombianos, propósito que se enmarca en los objetivos de la Corporación para el Desarrollo Participativo de los Pequeños Agricultores Colombianos, PBA. La obtención de dichas varieda­des por medio del fitomejoramiento sólo es posible sí se conoce la diversidad genética del ñame en Colom­bia. Existen dos colecciones parciales que incluyen gran parte de la diversidad de ñame; sin embargo, di­chas colecciones deben ampliar la caracterización, fortaleciendo el banco de germoplasma y la obtención de información encaminada a futuros trabajos de me­joramiento. Por estas razones se caracterizaron las variedades de ñame utilizadas en campo pertenecien­tes a una de las colecciones existentes, así como al-	gunas muestras de especies silvestres con una técni­ca de biología molecular: "DNA Amplification Fingerprinting (DAF)" (Caetano-Anollés et al., 1991). Esta técnica incluye amplificaciones del ADN genómico por "PCR" con un único oligo de secuencia aleatoria, lo que permite obtener bandas discretas utilizadas para la caracterización de cada individuo. En este trabajo se utilizaron las condiciones de baja y alta concentración de templete de ADN y oligo, respectivamente, reportados por el autor de la téc­nica. Éstas se han empleado para estimar la varia­ción genética de plantas (Cornus florida L.), (Caetano-Anollés etal., 1999) y evaluar la estabili­dad genética de dos importantes cultivares de pas­tos Tifgreen y Tifdwarf, y más recientemente para el mapeo del genoma de trigo (Triticum aestivum) (Caetano-Anollés, 1998, Gupta et al., 1999), guisan­tes (Pisum sativum L) (Men et al., 1999) y garban­zo (Cicer arietinum L.) (Winter et al., 1999). MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal Se utilizaron 71 accesiones de diferentes cultivares de ñame, recolectadas en diferentes locaciones de la costa atlántica colombiana, pertenecientes al ban­co de germoplasma de ñame de la Universidad de Córdoba (Durango et al., 1998), 40 accesiones del banco de germoplasma de ñame africano, genero­samente donadas por el IITA (International Institute of Tropical Agriculture Ibadan-Nigeria), y las acce­siones D. vitatta y D sansibarensis, obtenidas de la colección de la Universidad de Frankfurt (tabla 1). Extracción de ADN La extracción de ADN se realizó siguiendo el proce­dimiento reportado por Asemota (1991) para el aisla­miento de ADN de tubérculos de ñame, con algunas modificaciones, entre ellas la más importante fue el uso de DTT (ditiotreitol) como reductor de proteínas en remplazo del (3-mercaptoetanol.
	58

	CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GERMOPLASMA DE ÑAME COLOMBIANO UTILIZANDO DAF
	59

	REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL. V No.2 Diciembre 2003 57 - 63
	DNA amplification fingerprinting en condiciones radiactivas Los perfiles de DAF fueron generados con 8 diferentes oligos (tabla 2), siguiendo el procedimiento de Caetano-Anollés et al. (1991), con las modificaciones pertinen­tes para realizarlos en condiciones radiactivas. Las re­acciones de PCR de 10 |al contenían 10ng de ADN genómico, 0.2 mM de dCTP, dGTP y dTTP respectiva­mente, 0.02 mM de dATP, 0.065 ni de [o^PJ-dATP, 40 pmol de oligo y 0.25 unidades de Taq DNA polymerasa (Biotherm, Gene Craft). Un termociclador (Eppendorf Mastercycler® gradient) fue programado para 40 ciclos, con un paso de denaturación de 15 s, 94 °C, con una temperatura de anillamiento de 35 °C durante 20 s y un paso extensión con una temperatura de 72 °C durante 1 min. Después de la amplificación, las muestras fue­ron diluidas en agua en proporción 1:1, colocadas para separación en un gel de secuenciación con una con­centración de 4% de poliacrilamida y 40% de úrea con un tiempo de corrido de 3 h a 100 w, al cabo del cual se expuso 12 h con películas de rayos X (Kodak™X-ray) sin pantallas intensificadoras (Sambrook et al., 2000). ANÁLISIS DE DATOS Bandas registradas con DAF de manera inequívoca fue­ron transformadas en una matriz binaria con 1 para pre­sencia y 0 para ausencia de la banda en una posición particular. A partir de esta matriz, empleando el índice de similaridad de Dice, se calculó una ma­triz de similaridad que se computó di­rectamente con el paquete estadístico GELSTATS ("GELSTATS versión 2.6" University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio, 1996) de acuerdo con Nei y Li (1979). El dendograma final se cons­truyó utilizando la estrategia de agru­pamiento UPGMA con el paquete es­tadístico STATISTICA (1984-1999 Stat Soft. Inc., Dhillon et al., 1999). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se analizaron todas las accesiones con 8 diferentes oligos. Se obtuvie­ron patrones de bandeo diferentes muy reproducibles con todos los oligos utilizados. Un ejemplo de los patrones obtenidos se muestra en la figura 1, correspondiente a la foto­grafía del gel obtenido con el oligo
			OPH-11. Realizada la revisión de los geles, se ob­servaron 84 bandas totales, de las cuales 33 fueron monomórficas, lo que corresponde al 40% del total de las bandas. Se observó un rango de 2.5 bandas polimórficas por oligo utilizado. Después de hacer el análisis estadístico de los resultados se obtuvo una diversidad de la colección de 0.0413, con una media de similaridad de 0.9587, valores que se encuentran entre O y 1. Estos datos corresponden a la comparación total de las mues­tras utilizadas en este estudio. Si se tiene en cuenta que los rangos de similaridad cercanos a 1 indican altos grados de similitud y que valores de diversidad
	60

	CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GERMOPLASMA DE ÑAME COLOMBIANO UTILIZANDO DAF
	cercanos a 0 señalan baja diversidad, puede sugerirse, de estos resultados, que se refleja clara­mente una baja diversidad genética, aun cuando la técnica aquí reportada se estandarizó, en nuestro caso en condiciones radiactivas, para aumentar el poder de discriminación de la misma, y que la poca diversidad presentada en los agrupamientos obser­vados en el dendograma (figura 2) obedecen a la separación entre especies, obviamente esperada.	polimórficas por ensayo, lo que ocasiona agrupamientos cerrados claramente observados en el dendograma. Los resultados obtenidos en este estudio pueden estar relacionados con el hecho de que el ñame es una planta dioica, con flores imperfectas producidas en plan­tas diferentes (Amirato, 1984); por tanto, existen plan­tas masculinas y plantas femeninas. Como se trata de un cultivo de propagación vegetativa por parte de los
			cultivadores, se tienen clones o cultivares masculinos y femeni­nos, y otros que no florecen (Abraham et al., 1987). En gene­ral, se considera que las dificul­tades para obtener reproducción sexual en el ñame se deben fun­damentalmente a fenómenos de poliploidía que han llevado a la especie a una virtual esterilidad sexual (Martin et al., 1969). Debido a que ésta es una especie introducida en Colom­bia, sólo se han identificado al­gunas plantas masculinas y se han reconocido pocos cultivares femeninos, razón por la cual no se han realizado cruzamientos, y los trabajos de mejoramiento genético han estado limitados a
	Figura 2. Dendograma obtenido con el análisis de agrupamientos por UPGMA.		evaluaciones agronómicas de los
	Comparando los individuos de la especie D. alafa y D. rotundata pertenecientes a las colecciones colombiana y africana, se observó una elevada simi-laridad, caso que puede ser explicado por la relación de las accesiones colombianas con sus ancestros africanos, ya que los individuos de la colección afri­cana se agrupan claramente con los de la colombia­na dentro de cada una de las especies (Coursey et al., 1970,1976a, 1976b). Cabe anotar, además, que los resultados de las accesiones colombianas con-cuerdan con resultados previos de caracterización molecular utilizando AFLP (Amplification Fragment Lengh Plolimorphisms, Bustamante et al., 2001), en los que, de siete variedades reportadas, se encontró que sólo se podían diferenciar tres, lo que se puede relacionar con los valores de similaridad y diversidad obtenidos aquí. Por otro lado la variación somaclonal, otra posible causa de variabilidad, también se encuen­tra en bajas proporciones pues de ocho caracteres ana-lizados sólo se obtuvo un rango de 2.5 bandas	materiales presentes en las dos colecciones existentes (Álvarez, 2000). Esto po­dría explicar, en cierta proporción los resultados ob­tenidos con la caracterización molecular. CONCLUSIONES De los resultados obtenidos en este trabajo puede concluirse, en primera instancia, que la técnica utili­zada no permitió establecer grandes diferencias en las especies de Dioscorea caracterizadas, pues la similaridad encontrada entre los individuos fue muy alta aunque, como se mencionó, las condiciones de radiactividad aumentan el poder de discriminación de una técnica. Ahora bien, si se tiene en cuenta que las características agronómicas y sistemáticas del ñame, así como sus condiciones de propagación clonal y la característica especial de ser dioica, pue­den influir directamente en este resultado ya que es­tas características hacen que la similaridad aumente y la diversidad disminuya, cabe anotar entonces que
	61

	REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA VOL V No.2 Diciembre 2003 57 - 63
	para efectos del cultivo comercial de ñame en Co­lombia esta situación es de gran importancia, pues la poca diversidad genética podría eventualmente au­mentar la vulnerabilidad del cultivo en campo a pla­gas y enfermedades, de forma que el trabajo aquí realizado contribuye a complementar la información que se tiene de las colecciones de ñame existentes en Colombia con miras a establecer posibles solu­ciones para aumentar la diversidad del cultivo y con­seguir, de esta manera, aumentar la sostenibilidad de los pequeños productores de ñame en la costa atlántica colombiana. También se puede recomendar, a partir de los resultados de este trabajo, la utilización de una técni­ca con mayor poder de discriminación que la utiliza­da aquí, para confirmar los resultados o, sí es el caso, para establecer posibles individuos de la colección con potencial para ser utilizados en campo. Sin em­bargo, lo obtenido aquí hace pensar en la necesidad imperiosa de iniciar estudios de fitomejoramiento genético del ñame en Colombia, pues es una posibi­lidad viable aumentar la diversidad del cultivo y dis­minuir la vulnerabilidad del mismo en campo, ya que los marcadores moleculares son herramientas utili­zadas en estudios de mejoramiento (trigo) (Gupta et al., 1999). Trabajos como este se podrían encaminar hacia ese objetivo en el cultivo de ñame. Finalmente es pertinente completar la informa­ción que se tiene de la colección de ñame en la Uni­versidad de Córdoba, de modo que se pueda esta­blecer un banco de germoplasma bien estructurado y unificado que brinde a los pequeños productores variedades seleccionadas de buen comportamiento en campo. Esto es posible teniendo el máximo de información, entre ella conociendo la diversidad genética existente en Colombia, continuado con los trabajos de caracterización e iniciando los trabajos encaminados al fitomejoramiento. AGRADECIMIENTOS La investigación contenida en esta publicación fue llevada a cabo bajo el auspicio de la Corporación para el Desarrollo Participativo y Sostenible de los Pequeños Agricultores Colombianos, PBA, con el apoyo financiero del Ministerio de Desarrollo y Co­operación de Holanda y el apoyo logístico de CEGA, (La responsabilidad del contenido de las opiniones expresadas pertenecen solamente a los autores y no constituyen respaldo de CEGA ni de la agencia	aportante de los fondos). S. Bustamante agradece las becas de la Unesco (París, Francia) y de la Fun­dación para la Formación de Investigadores Inter­nacionales de la Universidad Wolfang Goethe de Frankfurt (Frankfurt am Main, Alemania). Los auto­res también agradecen a Diego Riaño (Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia). BIBLIOGRAFÍA Abraham, K.; Nair, S.; Sreejumari, M.; Unnikrishnan, M.; Babu, L.; Palaniswami, M. 1987. Genetic resources of greater yam. Technical Bulletin Series 9. Central Tuber Crop Research Institute (CTCRI). Kerala. India, p. 24. Asemota H.N. 1995. A fast, simple, and efficient mini-scale method for the preparation of DNA from tissues of yam (Dioscorea spp.). Plant Mol. Biol. Rep. 13: 214-218. Álvarez, A. 1991. Control de la antracosis en ñame. Instituto Colombiano Agropecuario (ICA). El Carmen de Bolívar. Documento de trabajo, p. 15. _________.2000. Prácticas agronómicas para el cultivo del ñame. En: Ñame: producción de semillas por biotecnología. Uni­versidad Nacional de Colombia. Instituto de Biotecnología. Editorial Unibiblos. Ammirato, P. 1984. Yams. In: Ammirato, P.; Evans, D.; Sharp, W.; Yamada, Y. (Eds.) Handbook of Plant Cell Culture, vol. 3, New York: MacMillan, pp. 327 - 354. Ayensu, G. 1972. Anatomy of the Monocotyledons. VI. Dioscoreales. Oxford: Oxford University Press, p. 182. Bustamante, S.; Guzmán, M.; Buitrago, G. 2001. Molecular characterization of some species and varieties of yam present on the Colombian Atlantic Coast. Rev Col Bio 2: 38-43. Caetano-Anollés, G.; Bassam, B.J.; Gresshoff, P.M. 1991. DNA amplification fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9: 294-307. _________. 1998. Genetic instability of bermudagrass (Cynodon) cultivars Tifgreen' and Tifdwaif’ detected by DAF and ASAP analysis of accessions and off-types. Euphytica 101:165-173. Caetano-Anollés, G.; Schlarbaum, S.E.; Trigiano, R.N. 1999. DNA amplification fingerprinting and marker screening for pseudo-testcross mapping of flowering dogwood (Cornus florida L). Euphytica 106: 209-222. Coursey, D.G.; Martin, R.W. 1970. The past and future of yams as crop plants. In: Proceedings Second Symposium of Tropical Root Crops, Hawaii 1: 87-90; 99-101. Coursey, D.G. 1976a. Yams Dioscorea spp. (Dioscoraceae). In: Evolution of Crop Plants. N.W. Simmonds (Ed.). London and New York: Longmans, pp. 70-74. Coursey, D.G. 1976b. The origins and domestication of yams in Africa. In: Origins of African Plant Domestication. Harlan, J.R.; de Wet, J.M.J.; Stemler, A.B.L (Eds.) The Hague, Mouton, pp. 383-403. Durango, R.; Padilla, A. 1998. Caracterización morfológica de un banco de germoplasma de ñame Dioscorea spp re­colectado en la costa norte colombiana. Trabajo de gra­do. Universidad de Córdoba, Montería, Colombia.
	62

	CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GERMOPLASMA DE ÑAME COLOMBIANO UTILIZANDO DAF
	Dhillon, N.P.S.; Ishiki, K. 1999. Genomic variation and genetic relationship in Ipomoea spp. Plant Bread 118:161-165 Gupta, P.K.; Varshney, R.K.; Sharma, P.C.; Armes, B. 1999. Molecular markers and their applications in wheat breeding. Plant Breed 118: 369 -390. IITA International Institute of Tropical Agriculture. 1993. Yams (Dioscorea spp) Root and tuber inprovement Program. Archival report (1989 - 1993). Ibadan. Nigeria. Martin, R; Delphin, H. 1969. Techniques and problems in the propagation of sapogenin-bearing yams from stem cuttings. J. Agric. Univ. Puerto Rico, 53:191 -198. Ministerio de Agricultura Colombiano. 2000. Reporte Anual. Men, A.E.; Borisov, A.Y.; Rozov, S.M.; Ushakov, K.V.; Tsyganov, V.E.; Tikhonovich, LA.; Gresshoff, P.M. 1999. Identification of DNA amplificaron fingerprinting (DAF) markers close to the symbiosis-ineffective sym31 mutation of pea (Pisum sativum L). Theor Appl Genet 98:929-936.	Nei, M.; Li, W.H. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci. USA 76: 5269-5273. Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. 2000. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. Winter, P.; Pfaff, T.; Udupa, S.M.; Hüttel B.; Sharma, P.C.; Sahi, S.; Arreguin-Espinoza, R.; Weigand, F.; Muehlbauer, F.J.; Kahl, G. 1999. Characterization and mapping of sequence-tagged microsatellite sites in the chickpea (Cicer arietinum L.) genome. Mol. Gen. Genet. 262: 90-101.
	63