Publicado

2003-07-01

Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa

Identification of R1 and R2 Genes conferring resistance to Phytophthora infestans in Colombian potato genotypes

Palabras clave:

genes de resistencia, marcadores moleculares, Phytophthora infestans, Solanum tuberosum ssp. tuberosum, Molecular markers, resistant genes (es)

Autores/as

  • Marcela Díaz M. Bióloga
  • Diego A. Fajardo Biólogo
  • José Dilmer Moreno Ingeniero Agrónomo
  • Celsa García Ingeniera Agrónoma
  • Víctor M. Núñez Ingeniero Agrónomo
En Colombia, actualmente existen genotipos de papa con excelente calidad industrial pero muy susceptibles a P. infestans. La mejor manera de combatir este problema es mediante resistencia genética, puesto que la inversión para controlar esta enfermedad por medios químicos es muy costosa, sin olvidar la contaminación ambiental que producen. El objetivo de este trabajo fue la identificación de genes R1 y R2 en los diferenciales de papa respectivos (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) mediante evaluación de resistencia a P. infestans y la detección molecular por medio de PCR (alelo R1) y AFLP (alelo R2). Para la detección del alelo R1 fueron empleados los primers GP179, GP21, 76-2SF2/76-2SR, SPUD237 y Sol 2749-2770F / Sol 3246-3267R. Los primers GP179, GP21 y SPUD237 fueron inespecíficos para Rl, ya que se generó un producto de amplificación en los diferenciales 1 y 2, así como también en Solanum phureja. Los primers 76-2SF2/76-2SR, y Sol 2749-2770F / Sol 3246-3267R generaron un producto de amplificación en los diferenciales 1 y 2; por el contrario, el fragmento estuvo ausente en el material susceptible. Para la detección del alelo R2, fueron implementados cinco marca­dores AFLP, de los cuales sólo dos fueron reconocidos visualmente en el diferencial 2. Los resultados mostra­ron una evidente correspondencia fenotípica y genotípica con respecto a la presencia de los genes Rl y R2. La identificación molecular de genes de resistencia a P. infestans permitirá desarrollar programas de mejoramiento genético que beneficien directamente los rendimientos de los cultivos de papa, sobre todo los de mayor interés industrial para nuestro país.
Excellent industrial quality potato genotypes are currently available in Colombia; however, they are very sus­ceptible to P. infestans. The best way of fighting this problem is by genetic resistance, given that the expense of controlling this disease through chemicals is high, plus the environmental contamination provoked. This work try to identify R1 and R2 major genes in respective potato differentials (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) by evaluating P. infestans resistance and their molecular detection by PCR (allele R1) and AFLP (allele R2). GP179, GP21, 76-2SF2/76-2SR, SPUD237 and Sol 2749-2770F/Sol 3246-3267R markers were used for R1 allele detection. GP179, GP21 and SPUD237 markers were non-specific for Rl because an amplification product was generated in differentials 1 and 2 as well as S. phureja. 76-2SF2/76-2SR and Sol 2749-2770F/Sol 3246-3267R markers created an amplification product in differentials 1 and 2, whilst the fragment was absent in the susceptible material. Five AFLP markers were used for R2 allele detection; only two of these were visually recognised in differential 2. The results showed evident phenotypic and genotypic correspondence respecting R1 and R2 gene presence. Molecular identification of P. infestans resistant genes will allow breeding programmes to be developed, directly benefiting potato crop yields, above all those having the greatest industrial interest for our country.
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Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos
colombianos de papa
Identification of R1 and R2 Genes conferring resistance
to Phytophthora infestans in Colombian potato genotypes
Marcela Díaz M.*, Diego A. Fajardo**, José Dilmer Moreno* **, Celsa García* ***,
Víctor M. Núñez* ****.
RESUMEN
En Colombia, actualmente existen genotipos de papa con excelente calidad industrial pero muy susceptibles a P. infestans. La mejor manera de combatir este problema es mediante resistencia genética, puesto que la inversión para controlar esta enfermedad por medios químicos es muy costosa, sin olvidar la contaminación ambiental que producen. El objetivo de este trabajo fue la identificación de genes R1 y R2 en los diferenciales de papa respectivos (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) mediante evaluación de resistencia a P. infestans y la detección molecular por medio de PCR (alelo R1) y AFLP (alelo R2). Para la detección del alelo R1 fueron empleados los primers GP179, GP21, 76-2SF2/76-2SR, SPUD237 y Sol 2749-2770F / Sol 3246-3267R. Los primers GP179, GP21 y SPUD237 fueron inespecíficos para Rl, ya que se generó un producto de amplificación en los diferenciales 1 y 2, así como también en Solanum phureja. Los primers 76-2SF2/76-2SR, y Sol 2749-2770F / Sol 3246-3267R generaron un producto de amplificación en los diferenciales 1 y 2; por el contrario, el fragmento estuvo ausente en el material susceptible. Para la detección del alelo R2, fueron implementados cinco marca­dores AFLP, de los cuales sólo dos fueron reconocidos visualmente en el diferencial 2. Los resultados mostra­ron una evidente correspondencia fenotípica y genotípica con respecto a la presencia de los genes Rl y R2. La identificación molecular de genes de resistencia a P. infestans permitirá desarrollar programas de mejoramiento genético que beneficien directamente los rendimientos de los cultivos de papa, sobre todo los de mayor interés industrial para nuestro país.
Palabras clave: genes de resistencia, marcadores moleculares, Phytophthora infestans, Solanum tuberosum ssp. tuberosum.
ABSTRACT
Excellent industrial quality potato genotypes are currently available in Colombia; however, they are very sus­ceptible to P. infestans. The best way of fighting this problem is by genetic resistance, given that the expense of controlling this disease through chemicals is high, plus the environmental contamination provoked. This work try to identify R1 and R2 major genes in respective potato differentials (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) by evaluating P. infestans resistance and their molecular detection by PCR (allele R1) and AFLP (allele R2). GP179, GP21, 76-2SF2/76-2SR, SPUD237 and Sol 2749-2770F/Sol 3246-3267R markers were used for R1 allele detection. GP179, GP21 and SPUD237 markers were non-specific for Rl because an amplification product was generated in differentials 1 and 2 as well as S. phureja. 76-2SF2/76-2SR and Sol 2749-2770F/Sol 3246-3267R markers created an amplification product in differentials 1 and 2, whilst the fragment was absent in the susceptible material. Five AFLP markers were used for R2 allele detection; only two of these were visually recognised in differential 2. The
Bióloga, Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias, Bogotá, Colombia. Biólogo, Esp., Corpoica, Programa Nacional de Recursos Genéticos y Biotecnología Vegetal, Tibaitatá. Ingeniero Agrónomo, Ph.D., Corpoica, Programa Agrícola Regional Uno, Tibaitatá.
Ingeniera Agrónoma, Ph.D., Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Agronomía, Bogotá, Colombia. **** Ingeniero Agrónomo, Ph.D., Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA), Programa Nacional de Recursos Genéticos y Biotecnología Vegetal, Tibaitatá, km. 14 vía Mosquera (Cundinamarca), A.A. 240142, Las Palmas, Bogotá, Colombia, e-mail:. vnunez@corpoica.org.co
Recibido: Febrero 24 de 2003. Aceptado: Julio 15 de 2003.
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IDENTIFICACIÓN DE GENES Rl Y R2 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A Phytophthora infestans
results showed evident phenotypic and genotypic correspondence respecting R1 and R2 gene presence. Molecular identification of P. infestans resistant genes will allow breeding programmes to be developed, directly benefiting potato crop yields, above all those having the greatest industrial interest for our country.
Key words: Molecular markers, Phytophthora infestans, resistant genes, Solanum tuberosum ssp. tuberosum
INTRODUCCIÓN
La papa es un producto agrícola de consumo masivo para la población colombiana, especialmente en los estratos con menores ingresos. El consumo de papa en el país se encuentra hoy alrededor de 71 kg/per-sona/año. Su producción total disponible se destina básicamente a dos usos: el consumo en fresco (80 a 92%) y la industria (7 a 8%) (Carvajal et al., 2000).
La gota, causada por Phytophthora infestans Mont. de Bary, produce en América Latina la destruc­ción o quemazón del follaje y la pudrición seca de los tubérculos de papa (Estrada, 2000; Zapata, 2000). En Colombia, los fungicidas son el principal mecanismo de control de la gota, su inversión representa el 8% de los costos de producción totales (Del Valle, 1997).
El mejoramiento genético, como mecanismo de control de P. infestans, está basado en: la resisten­cia monogénica y la resistencia poligénica. La re­sistencia monogénica solamente es efectiva contra ciertas razas del patógeno, controlada por genes do­minantes R, provenientes de Solanum demissum (Malcomsom y Black, 1966). En este tipo de resis­tencia se ha demostrado el concepto gen por gen (Agrios, 1996; Flor, 1971; Day, 1974; Vanderplank, 1984; Gebhardt y Valkonen, 2001). La resistencia poligénica es cuantitativa, controlada por muchos genes, cada uno de los cuales puede contribuir en mayor o menor grado a la resistencia (Henfling, 1987; Hardy et al., 1996; Young, 1996; Watanabe y Watanabe 2000).
El propósito de este trabajo fue identificar genes mayores R1 y R2 mediante la evaluación de resis­tencia a P. infestans en genotipos colombianos de Solanum tuberosum ssp. tuberosum y su detección molecular por medio de PCR (alelo R1) y AFLP (alelo R2). Una vez se tengan identificados los genes que confieren resistencia a P. infestans mediante tecno­logía molecular, se podrán introgresar los alelos de resistencia a materiales de papa de interés industrial para Colombia por medio de mejoramiento conven­cional, y de este modo desarrollar estrategias eficien-
tes en la selección asistida por marcadores encami­nadas al mejoramiento genético vegetal (Ribaut y Hoisington, 1998).
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización. El presente trabajo se llevó a cabo en el centro de investigaciones Tibaitatá-Corpoica, localizado en el departamento de Cundinamarca, municipio de Mosquera, km 14 de Bogotá, D. C, a una latitud norte de 42' y una longitud oriente de 74° 12'; su altitud de 2543 (msnm). Su clasifi­cación ecológica (Holdridge) es bosque seco Montano Bajo (bs-MB). Este trabajo fue desarro­llado en el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología del Programa Nacional de Recursos Genéticos y Biotecnología Vegetal.
Material vegetal. Se trabajó con 12 reproduc­ciones de la variedad Diacol Monserrate (Solanum tuberosum ssp. andigena, presenta resistencia poligénica y carece de genes mayores), cinco repro­ducciones del diferencial 1 (reproducciones de Solanum tuberosum ssp. tuberosum con gen específico R1), siete reproducciones del diferencial 2 (reproducciones de S. tuberosum ssp. tuberosum con gen específico R2). También se trabajó con 75 reproducciones de la variedad Diacol Capiro (material muy susceptible a gota), exclusivamente para la activación de la virulen­cia de los aislamientos de P. infestans, así como tam­bién con tubérculos de la variedad Tuquerreña (mate­rial susceptible a gota). Los diferenciales fueron multiplicados mediante esquejes de tallo juvenil (Cor­zo, 1998). Así mismo, fueron colectadas hojas de 69 plantas de Diacol Monserrate multiplicadas por esque­jes de tallo juvenil y suministradas por el Programa Regional Agrícola de la Regional Uno de Corpoica. El material vegetal fue caracterizado con la ayuda de descriptores morfológicos del CIP (Huaman, 1994).
Evaluación de resistencia a P. infestans
Recolección de material vegetal. Tres foliolos de hojas sanas completas (Diacol Monserrate y diferen­ciales de papa, con un mes de desarrollo aproxima-
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Obtención del inoculo. Se utilizaron los aisla­mientos de P. infestans: 276p, 245L, 87L y H1N (Tabla 1), colectados del altiplano cundiboyacense (municipios de Siecha, Cucunubá, Toca) y Antioquia, facilitados por el grupo de investigación en papa de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia.
tración final de esporangios fue de 4.2 - 5.1 E 4esp/ml. En el envés de cada folíolo se aplicó una alícuota de la suspensión (10 yS). Se montaron diez repeticiones para la inoculación con cada uno de los aislamientos. La incubación se realizó a 18 °C con 12 horas diarias de luz y 100% de humedad relativa.
Análisis de la Evaluación de Resistencia a P. infestans. La evaluación se realizó cinco días des­pués de la inoculación, donde se observó la presencia o ausencia de genes R en el material de papa. Se utilizó Diacol Monserrate como material testigo por­que presenta resistencia poligénica y carece de genes R (no se empleó Solanum phureja como testigo por ser susceptible a gota). Se registró la reacción de com­patibilidad (+) o de incompatibilidad (-), teniendo en cuenta el número de foliolos con lesiones esporulantes o no esporulantes respectivamente, por cada una de las diez repeticiones. Se registró una reacción com­patible cuando se observó esporulación (del hongo) en al menos dos foliolos. El resultado definitivo de la evaluación de resistencia a P. infestans se obtuvo de la moda. Se llevó a cabo un análisis estadístico com­plementario -Análisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo (Excel-Windows 98) o factorial (aislamientos / materiales de papa)- con res­pecto al número de foliolos con lesiones esporulantes.
Detección molecular
Extracción de ADN. Se extrajo ADN de los materia­les de papa: diferencial 1 (R1), diferencial 2 (R2), y S. phureja fue empleado como control negativo. Nóte­se que Diacol Monserrate, al poseer resistencia poligénica, no fue empleado como control negativo en esta sección puesto que un QTL de resistencia a P. infestans se encuentra ubicado en una región muy cercana al gen R1 en el cromosoma V de la papa (Gebhardt y Valkonen, 2001). Se evitó el uso de Diacol Monserrate para evitar la presencia de falsos positi­vos en contraste con los diferenciales de papa 1 (R1) y 2(R2) en las pruebas moleculares. Por tal motivo se escogió S. phureja como control negativo (mate­rial susceptible a gota, carece de genes mayores). El aislamiento de ADN genómico se basó en los proto­colos de CIP (1998) y Wizard® Genomic DNA Purificaron Kit (Promega).
Procedimiento con PCR para la detección de alelo R1. Se realizó PCR con cinco primers específi­cos al alelo R1 (Tabla 2): GP179 y GP21 (Meksem et al., 1995); 76-2SF2/76-2SR (Ballvora et al., 2002);
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Activación de la virulencia de aislamientos de P. infestans. Para la multiplicación del patógeno, se emplearon los medios de agar-arveja y agar-V8. Luego de tres subcultivos (un subcultivo mensual) de cada uno de los aislamientos, se activó su viru­lencia mediante la inoculación del patógeno en foliolos de papa Diacol Capiro (muy susceptible a gota); des­pués de una semana aproximadamente, se observa­ron las lesiones esporulantes y cada trozo de tejido de hoja enfermo se colocó debajo de una rodaja (0.5-1.00 cm de grosor) de papa Tuquerreña (susceptible a gota) previamente desinfectada (hipoclorito de sodio al 2% y etanol al 70%). Al cabo de cinco días se ob­servó el crecimiento del micelio. Este micelio fue nue­vamente sembrado en medio de cultivo.
Inoculación. Se preparó una suspensión de esporangios a partir del inoculo contenido en la caja de Petri (10-20 días de crecimiento y patogénicamente activo), al cual se le agregó 1.0 ml de agua destilada; el lavado se filtró para separar el micelio. Se realizó un conteo de esporangios del filtrado mediante el hematocitómetro (mínimo seis conteos). La concen-
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SPUD237 (De Jong et al., 1997; Ballvora etal. 2002) y Sol 2749-2770F/ Sol 3246-3267R, diseñados a partir de la secuencia del gen R1 (GenBank) en el progra­ma público de Internet Jellyfish versión 2.1 (biowire.com 2000-2002). Los moldes de ADN fueron diferencial 1, diferencial 2 y S. phureja (material sin genes mayores, control negativo). Las condiciones de PCR y progra­mación del termociclador para los primers GP179 y GP21 fueron según Meksem et al. (1995), para el res­to de primers las condiciones y temperaturas para la amplificación fueron ajustadas en este trabajo.
Análisis para la detección del alelo R1. Se
realizó electroforesis en gel de agarosa al 1.5-2.0% preparado en buffer TBE 1X teñido con bromuro de etidio (0.3 |ag/ml). La presencia o ausencia de la am­plificación de los fragmentos fue corroborada en el documentador de geles (SynGene Gene Snap 4.00), así como el peso molecular empleado (escalera de 123 pb y 50 pb para agarosa) en el documentador de geles (SynGene Gene Tools 3.00).
Se realizó la ligación de los adaptadores EcoA y MseA (Invitrogen) al ADN digerido en una reacción de 50 (¿I: buffer 1X (Invitrogen), 0.1 |j.M de EcoA, 0.1 |j.M de MseA, 1 U de T4 ligasa (Invitrogen), 35 jlxI de ADN digerido. La solución se diluyó 1:4.
Se llevó a cabo la reacción de pre-amplificación empleando primers más un nucleótido selectivo. Cada reacción de 20 \i\: 1.5 ng de primer Eco + 1 (Gibco BRL), 1.5 ng de primer Mse + 1 (Gibco BRL), 0.2 mM de dNTPs, buffer 1X (Gibco BRL), 5 jllI de ADN liga­do, amplificada por 0.4 U de taq polimerasa (Invitrogen). La solución se diluyó 1:25. Las reaccio­nes de pre-amplificación fueron sometidas a las con­diciones establecidas por el CIP (1998) en el termociclador MJ Research PTC-200.
Por último, se realizó la reacción de amplifica­ción selectiva, empleando cinco combinaciones de primers más tres nucleótidos selectivos (primer E + 3 y primer M + 3; Tabla 3): ACC/CAT, ACT/CAC, AGC/ CCA, ACT/CGC y ATC/CGA (Invitrogen) reportadas por U etal. (1998). Las concentraciones de los primers fueron ajustadas en las reacciones de PCR para que ocurriera la reacción de amplificación, puesto que unos primers provenían de kit comercial (AFLP Analysis System I - Gibco BRL), mientras que otros fueron sintetizados independientemente (Invitrogen). Las cinco combinaciones de primers se amplificaron en un termociclador MJ Research PTC-200, con los ciclos de temperaturas establecidas por el CIP (1998).
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Procedimiento con AFLP para la detección del alelo R2. Adaptado del Centro Internacional de la Papa, CIP (1998). El ADN genómico de los materiales de papa, diferencial 1, diferencial 2 y S. phureja fue digerido con la enzima Mse/(Invitrogen) en una reac­ción de 140 \A compuesta por 5 |u.g de ADN, 10 U en­zima Msel y React 1 Buffer 1X (Invitrogen). Se digirió nuevamente cada una de las muestras con la enzima EcoRI (Invitrogen) en una reacción de 200 compues­ta por 140 ]lxI de solución inicial de digestión enzimática (Msel), 10 U de enzima EcoRI y NaCI 0.1 M.
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Análisis para la detección del alelo R2. Se
efectuó electroforesis en gel denaturante de poliacrilamida al 6%-Urea 7M (González etal.,1995), en la cámara de secuenciación Modelo S2 (Gibco BRL). Finalmente, se llevó a cabo la tinción con ni­trato de plata (Payne, 1997). Se procedió al recono­cimiento visual de la presencia o ausencia de marca­dores utilizados en este trabajo tomando como referencia los pesos moleculares obtenidos por Li et al. (1998), y fueron comparados con el marcador de peso molecular empleado (escalera de 50 pb para poliacrilamida) en el documentador de geles Syngene Gene Tools 3.00.
RESULTADOS
Evaluación de resistencia a P. infestans. Con los
aislamientos H1N y 276p, las lesiones esporulantes observadas en los materiales de papa (diferenciales 1 y 2, Diacol Monserrate), correspondieron a una reac­ción de compatibilidad. El aislamiento HIN produjo la mayor esporulación en todos los materiales (Figura 1).
Fue observada una respuesta hipersentitiva (le­siones necróticas o puntos necróticos sin esporulación) en los diferenciales de papa inoculados con los aisla­mientos 87BL y 245L. Esta reacción reflejó la presen­cia de los genes R1 y R2 en el hospedante (diferen­ciales 1 y 2), así como de los genes Avr 1 y Avr2 en el patógeno (Figura 1).
Se encontró esporulación con todos los aisla­mientos del patógeno en Diacol Monserrate. No obs-
tante, esta esporulación fue menor comparada con la esporulación observada en los diferenciales, excepto en el aislamiento HIN, el cual esporuló más abundan­temente (Figura 1).
Con respecto al análisis de varianza de dos facto­res con diversas muestras por grupo o análisis factorial, se determinó que: a) sí hubo diferencia en cuanto al número de foliolos con lesiones esporulantes bajo los cuatro aislamientos (p < .05); b) sí hubo diferencia en cuanto al número de foliolos con lesiones esporulantes en los tres materiales de papa (p < .05); y c) sí existió interacción del aislamiento y el material en cuanto al número de foliolos con lesiones esporulantes. La com­binación de los factores influyó en el número de foliolos con lesiones esporulantes (p < .05).
Detección molecular del alelo R1. Con la utili­zación de los marcadores GP179 y GP21, se visualizaron los fragmentos amplificados de ADN pro­cedentes del diferencial 1. Con relación al marcador de peso molecular utilizado (escalera de 123 pb), la banda que correspondió al fragmento amplificado e iniciado por los primers GP179 (dos bandas), presentó la ma­yor movilidad electroforética, 550 pb aproximadamen­te, mientras que la banda correspondiente al fragmento amplificado e iniciado por los primers GP21 fue más pesada, aproximadamente 1230 pb (Figura no mostra­da). En los materiales usados como controles negati­vos (teóricamente no poseen el gen R1), es decir, el diferencial 2 y S. phureja, también se encontraron las mismas bandas (Figura no mostrada).
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En el presente trabajo, con los primers 76-2SF2 / 762SR se obtuvo una banda única con un tamaño de 1353 pb, en rela­ción con el marcador de peso molecular o escalera 123 pb (gel de agarosa al 1.5%), evidenciado en los di­ferenciales de papa uno y dos, que contie­nen los genes R1 yR2, respectivamente. El fragmento amplificado estuvo ausente en el material susceptible S. phureja (Figura 2).
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Figura 1. Evaluación de resistencia a P. infestans en genotipos tetraploides de papa, basada en la media aritmética del número de foliolos con lesiones esporulantes del total de las repeticiones. Nótese que no hubo foliolos con lesiones esporulantes en los diferenciales 1 y 2 bajo los aislamientos 87L y 245L. La mayor producción de foliolos con lesiones esporulantes ocurrió en los dos diferenciales bajo el aislamiento 276P. Se presentaron foliolos con lesiones esporulantes en Monserrate (testigo), con todos los aislamientos. D1: Diferencial 1, D2: Diferencial 2 y M: D. Monserrate.
Figura 2. Amplificación por PCR con los primers 76-2SF2/76-2SR en el gel de agarosa al 1.5% en moldes de ADN de: A) Diferencial 1 (fragmento de 1353 pb del gen R1); B) Diferencial 2 (fragmento de 1353 pb); C) S. phureja (fragmento ausente); y D) marcador de peso molecular, escalera de 123 pb.
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ron un fragmento de fuerte tonalidad, mientras que el marcador AGC/CCA produjo un fragmento tenue (Fi­guras 4 y 5).
DISCUSIÓN
Evaluación de resistencia a P. infestans. La ex­presión fenotípica observada cumple con la teoría del "gen por gen" expuesta por Flor (1971, que no es el objetivo de este trabajo) según la cual un
Figura 3. Amplificación por PCR con los primers SPUD237 y Sol 2749-2770F / Sol 3246-3267R en gel de agarosa al 1.5%. B-D: amplificación por los primers SPUD237 en B: diferencial 1 (403 pb), C: diferencial 2 (403 pb) y D: S. phureja (376 pb). F-G: amplificación por los primers Sol 2749-2770F/Sol 3246-3267R en F: diferencial 1 (519 pb), G: diferencial 2 (519 pb y H: fragmento ausente en S. phureja. A y E: marcador de peso molecular o esscalera de 50 pb.
Con los primers SPUD237, se obtuvo un pro­ducto de amplificación en los tres materiales con un peso aproximado de 403 pb (Figura 3). Con los primers Sol 2749-2770F/Sol 3246-3267R, se eviden­ció un fragmento de amplificación de 519 pb, en el diferencial 1 y en el diferencial 2; por el contrario, el fragmento estuvo ausente en el material susceptible S. phureja (Figura 3).
Detección molecular del alelo R2. Los pesos moleculares citados por Li et al. (1998) para cada una de las combinaciones de primers son: ACC/CAT-535, ACT/CAC-189, AGC/CCA-369, ACT/CGC-250, ATC/CGA-186. De las cinco combinaciones emplea­das en este estudio, se evidenciaron los productos de amplificación de dos combinaciones de primers, ACT/CAC y AGC/CCA, cuyos pesos moleculares están muy cercanos a los reportados por Li et al. (1998); éstos fueron: 196 pb y 365 pb respectivamente (Figuras 4 y 5), en relación con el marcador de peso molecular o escalera de 50 pb utilizado. Estas ban­das se observaron únicamente en el diferencial 2; por el contrario estuvieron ausentes en el diferencial 1 y S. phureja. Los marcadores ACT/CAC produje-
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Figura 4. Amplificación de fragmentos generada por marcadores AFLP, en gel de poliacrilamida 6%, úrea 7M (sección). A: marcador de peso molecular o escalera de 50 pb; B-D: fragmentos producidos por la combinación de primers ACC/CAT en los materiales de S. phureja, diferencial 2 y diferencial 1, respectivamente. E.G: fragmentos originados por la combinación de primers ACT/CAC, en los materiales de S. phureja, diferencial 2 (obsérvese la flecha que indica la presencia de la banda única en este material con un peso de 196 pb) y diferencial 1, respectivamente.
Figura 5. Amplificación de fragmentos generada por marcadores AFLP, en gel de poliacrilamida 6%, úrea 7M (sección). A-E: fragmentos producidos por la combinación de primers AGC/ CCA. A: S. phureja,- B y C: Diferencial 2 (nótese la flecha que señala la presencia única de un fragmento de peso 365 pb); D y E: diferencial 1; F-l, K: bandas originadas por la coimbinación de primers ACC/CAT; F: S. phureja, G y H: diferencial 2; I y K: diferencial 1; J: fragmentos producidos por la combinación de primers ATC/ CGA en el diferencial 1; L: marcador de peso molecular o escalera de 50 pb.
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gen de resistencia R en la planta interactúa con un gen de avirulencia (Avr) en el patógeno dando lugar a una reacción incompatible que se mani­fiesta por una respuesta hipersensitiva. Por el con­trario, si el patógeno carece del gen Avr o la plan­ta carece del gen R, la interacción planta-patógeno causa enfermedad.
Del aislamiento 276p se conocía su avirulencia de acuerdo con evaluaciones realizadas por otros in­vestigadores (Tabla 1), pero en este trabajo se demos­tró que no presenta los genes Avr 1 y Avr2. Es posible que este aislamiento se haya vuelto patogénico para estos genes, teniendo en cuenta que fue colectado de campo y, por tanto, no es monozoospórico.
Las lesiones esporulantes observadas en Diacol Monserrate con todos los aislamientos se explican por la resistencia poligénica de este material (Estrada, 2000; Hodgson, 1961). Esto significa que los genes menores de la planta muestran una fuerte resisten­cia al patógeno, pero le permiten una ligera esporulación, a excepción del aislamiento HIN, que es una raza muy compleja (Tabla 1).
Es preciso señalar que para evidenciar la pre­sencia de los genes R1 y R2, fueron empleados ais­lamientos de P. infestans mientras que en las investi­gaciones reportadas por Leonards-Schippers et al. (1992), Meksem et al. (1995), Li et al. (1998) y Ballvora et al. (2002), fueron utilizadas razas puras del pató­geno. Sin embargo, tanto con los aislamientos de P. infestans utilizados de este trabajo (Tabla 1) como con las razas de P infestansse conocía su avirulencia y virulencia.
Se debe clarificar que la técnica de inocula­ción de P. infestans en foliolos desprendidos de papa ha sido útil en investigaciones con P. infestans para identificar genes R (Leonards-Schippers et al., 1992; Meksem et al.,1995; Li et al.,1998; Ballvora etal., 2002) y que fue el objeto de este trabajo. Pero tam­bién ha sido aplicada para determinar la virulencia del patógeno (Jaramillo etal., 1997; Forbes, 1997), cuantificar resistencia parcial en cultivares y clones de papa (Méndez, 1998), identificar aislamientos agresivos de P. infestans, probar niveles de infec­ción y respuesta a la concentración de esporangios (Millar et al., 1998).
Se debe tener en cuenta un margen de error en la evaluación de resistencia, puesto que en determi-
nadas ocasiones, en las series de repeticiones de inoculaciones por aislamiento, se observó cierta va­riación en el número de foliolos esporulados (tres, dos o uno). Esto pudo deberse a que: a) aunque las concentraciones de esporangios utilizadas se encuen­tren dentro del rango establecido por el CIP (Forbes, 1997), el conteo de esporangios no haya sido exac­to; b) se haya presentado precipitación de los esporangios en suspensión, debido a su gran peso, lo cual, pudo haber afectado en el momento de apli­car la gota o inoculo; c) haya habido germinación desigual de los esporangios. Se debe descartar el efecto de las condiciones ambientales, ya que éstas fueron controladas y el material vegetal se recolectó luego de cinco a seis meses de desarrollo de la por­ción media de las plantas (Tooley, 1990; Stewart, 1990; Hodgson, 1961). No obstante que para contra­rrestar el margen de error en este trabajo, se tuvie­ron en cuenta diez repeticiones de inoculaciones por aislamiento de P. infestans, con el fin de tener mayor seguridad en los resultados (moda), conforme con el Grupo de Investigación en papa de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia (Bogotá, D.C.)
Detección molecular de alelo R1. Los alelos de los marcadores GP21 y GP179 ligados a R1, fue­ron inespecíficos para la presencia del gen R1, pues también fueron encontrados en los genotipos que portan el gen R2 y genotipos susceptibles.
Estos resultados, equiparados con los resulta­dos de Meksem et al. (1995), fueron idénticos en cuanto a la amplificación de fragmentos con estos primers en genotipos R1 y en las variedades susceptibles.
La interpretación a la amplificación de los primers GP179 y GP21 en los tres materiales (dife­rencial 1, diferencial 2 y S. phureja), para que sean inespecíficos al alelo R1, tiene que ver con la distan­cia genética a la que se encuentran los dos primers específicos respecto del alelo R1, ya que, de acuer­do con lo estipulado por Meksem et al. (1995) y Ballvora et al. (2002), el alelo R1 está localizado en el intervalo comprendido entre los marcadores GP21 y GP179 en el brazo corto del cromosoma V de la papa. Este intervalo tiene una distancia genética to­tal de 3cM. Así mismo, los marcadores GP21 y GP179 distan genéticamente 2.2 y 0.8 cM del gen R1, res­pectivamente. Estos valores se refieren, a su vez, a la frecuencia de recombinación entre estos segmen­tos, que es 2.2% y 0.8% (Ballvora et al., 2002).
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IDENTIFICACIÓN DE GENES R1 Y R2 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A Phytophthora infestans
El resultado con los primers SPUD237 (figura 3) indicó, que éstos no son específicos para el alelo R1, a pesar de que Ballvora et al (2002) afirman que estos marcadores se localizan a 0.1 cM del alelo R1. Sin embargo, De Jong et al. (1997) digirieron todos los productos de amplificación con la enzima Alu I y encontraron productos de digestión ligados a resistencia. Por tanto, queda pendiente realizar ese procedimiento para comprobar si esa estrategia funciona con los materiales de este trabajo.
Por tales explicaciones, para que haya mayor especifici­dad de primers y se obtengan datos más confiables en cuanto a la presencia del gen R1, es indispensable que los marcadores se localicen a una distancia genética más cercana al gen R1. Según esto, y conforme a los nue­vos hallazgos reportados por Ballvora et al. (2002), fueron implementados nuevos primers específicos al gen R1, denominados 76-2SF2/76-2SR, los cuales amplificaron un fragmento del gen R1 (figuras 2 y 6).
El resultado con los primers Sol 2749-2770F/ Sol 3246-3267R fue idéntico al encontrado con los primers 76-2SF2/76-2SR, salvo por el peso molecular de los fragmentos (519 pb y 1353 pb, respectivamen­te). Es de gran importancia anotar que estos dos ti­pos de marcadores no se encuentran ligados al gen R1, sino que amplifican secuencias del gen R1. El tamaño del fragmento de amplificación producido por ambos primers en el diferencial 1 fue corroborado con el Programa Jellyfish (figura 6).
Estos resultados son, por tanto, consistentes con los obtenidos por Ballvora et al. (2002), en cuan­to al fragmento amplificado por los primers 76- 2SF2/ 76-2SR y Sol 2749-2770F/Sol3246-3267R, pues estuvo presente en los materiales que contienen el gen R1 y estuvo ausente en los materiales suscep­tibles que no poseen el gen R1. No obstante, el frag­mento amplificado estuvo presente en el diferencial 2 (R2). Este resultado indica que estos marcadores no hacen distinción entre los diferentes genes ma­yores, lo cual sugiere que debe existir cierta homología entre las secuencias de estos genes. Lo
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confirma el artículo de Ballvora et al. (2002), donde dice que el gen R1 (secuencia complementaria al clon g10) presentaba secuencias similares (marco abierto de lectura) con genes de resistencia de otras plantas. Se requiere realizar estudios complemen­tarios de las secuencias de los diferenciales para comprobar si existe similitud entre éstas, por ejem­plo secuenciación, hibridación Southern, Northern, Western y Elisa, para comprobar si existe similitud entre las secuencias de estos genes.
Detección molecular de alelo R2. En cuanto al reconocimiento visual de las bandas respectivas, se puede afirmar que fue posible gracias a la detec­ción no radiactiva o tinción con nitrato de plata (Payne, 1997). Sin embargo, se percibió una gran variación entre cada una de las tinciones realizadas, por lo que se debería implementar en próximos estudios detec­ción radiactiva o detección quimioluminiscente.
Los dos marcadores ACT/CAC-189 y AGC/ CCA-369, reconocidos visualmente (figuras 4 y 5), reiteran la validez del mapa consenso construido por los investigadores Li et al. (1998), salvo por la com­binación ATC/CGA-186, que no fue encontrada en este estudio. Esto último quizá se debe a que los mapas de ligamiento y de consenso están basados en poblaciones de papa producidas en los países bajos (Bélgica, Holanda y Luxemburgo) y exista la posibilidad de que tal marcador no sea tan específi­co al R2 en los materiales nacionales, posiblemen-
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te por variación genética. De todas formas, el uso de este marcador podría verificarse mediante de­tección radiactiva.
Por último, se demostraron algunas de las pro­piedades de los AFLP (Vos et al., 1995; McGregor et al., 2000). En primer lugar son una herramienta molecular de alta eficiencia pues se genera un gran número de fragmentos polimórficos por cada combi­nación; en segundo lugar, son reproducibles.
Marcadores moleculares como método de identificación de genes de resistencia R1 y R2.
Es muy evidente que los resultados indicaron una co­rrespondencia fenotípica y genotípica en cuanto a la presencia de los genes R1 y R2 en los diferenciales de papa mediante la presencia de los marcadores li­gados a estos genes de resistencia (ACT/CAC-189 y AGC/CCA-369 ligados a R2; los marcadores 76-2SF2/ 76-2SR y Sol 2749-2770F/Sol3246-3267R específicos al gen R1), en referencia a la respuesta hipersensitiva encontrada en los genotipos de papa R1 y R2 hacia los aislamientos de P. infestans 245L y 87BL
Conforme a lo referido anteriormente, se obser­vó una gran similitud entre el diferencial 1 y el dife­rencial 2 no sólo en el aspecto fenotípico, donde la respuesta hipersensitiva hacia los aislamientos 87BL y 245L fue la misma, sino también en el molecular. Primero, el producto de amplificación dado por los primers específicos 76-2SF2/76-2SR y Sol 2749-2770F/Sol3246-3267R en el diferencial 1, se presentó en el diferencial 2; segundo, los fragmentos produci­dos en los dos diferenciales en cada una de las com­binaciones de marcadores AFLP utilizadas fueron muy similares entre sí.
El asunto en cuestión plantea la posibilidad de que alguno de estos genes haya evolucionado (lo cual explica que sean diferenciales) y que algunas de las secuencias se hayan conservado, como puede ser el caso de los motivos de proteína (García-Mas et al, 2001), tomando en consideración que estos genes provienen de plantas silvestres (S. demissum). Cuan­do se trabajó con el material vegetal, se emplearon descriptores morfológicos (Huaman, 1994) y el ítem de floración no se tuvo en cuenta (carácter de gran valor taxonómico), pues el material se colectó antes de esta etapa. Por tal razón es pertinente realizar es­tudios complementarios; por ejemplo, secuenciación de los fragmentos amplificados ligados a cada uno de
los genes, hibridación de la secuencia del gen R1 [se­cuencia disponible en el GenBank (Ballvora et al, 2002)] con la secuencia del R2 para comparar estos dos materiales en el nivel molecular, además de estu­dios bioquímicos como electroforesis de proteínas y esterasas (Contreras 1999).
En el presente estudio (aunque no era el objeti­vo del trabajo) se evidenció el concepto de gen por gen (Flor, 1971; Agrios, 1997) con la presencia de los marcadores ligados al alelo R2 (ACT/CAC-189 y AGC/ CCA-369) y marcadores específicos para el alelo R1 (76- 2SF2/76-2SR y Sol 2749-2770F/Sol3246-3267R) en referencia a 1) la reacción de compatibilidad entre el material de papa R1-R2 y los aislamientos 276P-HIN; 2) la respuesta hipersensitiva encontrada entre los genotipos de papa R1- R2y los aislamientos 245L-87BL. Pese a que los aislamientos de P. infestans ex­hibieron similar morfología macroscópica y microscó­pica, y de acuerdo con Gualtero (1997), los aislamien­tos estudiados aquí, y otros más, fueron homogéneos para la enzima glucosa-6-fosfato isomerasa y para proteínas solubles. Sus respuestas variaron ante su inoculación en los materiales de papa. Por último, por razón del análisis factorial comentado, se verificó que sí existió interacción entre cada uno de los aislamien­tos y los diferenciales de papa en cuanto al número de foliolos con lesiones esporulantes.
Para tener la absoluta certeza de que los genes R1 y R2 están presentes en los materiales de papa respectivos, aunque los resultados lo confirmen (prue­ba biológica y marcadores alélicos específicos), se necesita estudiar la expresión génica de estos, lo cual significa que se deben establecer cruzamientos entre materiales resistentes y susceptibles con el fin de evi­denciar la segregación de los alelos de resistencia.
Estos resultados implican que, si se comprue­ba la expresión de los genes de resistencia en la po­blación segregante, se justifica la aplicación inme­diata de los marcadores moleculares estudiados, en la selección de plantas que contienen genes de re­sistencia a P. infestans para fitomejoramiento (selec­ción asistida por marcadores moleculares), dirigido a los distintos materiales de papa colombianos, sobre todo en los materiales con excelente calidad indus­trial pero que son susceptibles y altamente suscepti­bles a P. infestans. Para el primer caso se encuen­tran parda pastusa, yema de huevo o criolla, y tuquerreña o sabanera; para el segundo caso se ha­bla de Diacol Capiro (Ñústez, 1999).
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IDENTIFICACIÓN DE GENES R1 Y R2 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A Phytophthora infestans
CONCLUSIONES
Se determinó la presencia de genes R1 y R2 en los diferenciales de papa 1 y 2 mediante la respuesta hipersensitiva observada bajo los aislamientos 87BI y 245L de P. infestans.
Se demostró la presencia del alelo R1 median­te los marcadores específicos 76-2SF2/76-2SR (Ballvora et al., 2002) y Sol 2749-2770F/Sol3246-3267R (Jellyfish).
Se determinó la presencia del alelo R2median­te los marcadores específicos AFLP ACT/CAC y AGC/CCA (Li et al., 1998).
Se encontró una correspondencia fenotípica y genotípica en cuanto a la presencia de los alelos R1 y R2 en los diferenciales de papa 1 y 2, respectiva­mente. Así mismo, se evidenció el concepto de gen por gen, expuesto por Flor (1971).
Sería deseable realizar estudios complementa­rios de las secuencias de los diferenciales para com­probar si existe similitud entre éstas; por ejemplo, secuenciación, hibridación Southern, Northern, Western y Elisa. Por otro lado, se debería implementar detección radiactiva o detección quimioluminiscente para la técnica de AFLP en los próximos estudios para facilitar la visualización de las bandas.
Los resultados del presente trabajo son de gran importancia para el estudio y control de la gota de los cultivos de papa en las zonas productoras de Colom­bia. La identificación de los genes que confieren re­sistencia a P. infestans mediante tecnología molecular permitirá desarrollar, con mayor eficiencia, programas de mejoramiento genético que beneficien de manera directa los rendimientos de los cultivos, en especial los de mayor interés industrial para nuestro país.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a Christiane Gebhardt, líder de Investigación asociada al Instituto Max Planck para el Mejoramiento de los Cultivos (Colonia-Alemania), por la comunicación oportuna de sus más recientes publicaciones aplicadas en este trabajo.
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Cómo citar

APA

Díaz M., M., A. Fajardo, D., Moreno, J. D., García, C. y Núñez, V. M. (2003). Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa. Revista Colombiana de Biotecnología, 5(2), 40–50. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/574

ACM

[1]
Díaz M., M., A. Fajardo, D., Moreno, J.D., García, C. y Núñez, V.M. 2003. Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa. Revista Colombiana de Biotecnología. 5, 2 (jul. 2003), 40–50.

ACS

(1)
Díaz M., M.; A. Fajardo, D.; Moreno, J. D.; García, C.; Núñez, V. M. Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa. Rev. colomb. biotecnol. 2003, 5, 40-50.

ABNT

DÍAZ M., M.; A. FAJARDO, D.; MORENO, J. D.; GARCÍA, C.; NÚÑEZ, V. M. Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa. Revista Colombiana de Biotecnología, [S. l.], v. 5, n. 2, p. 40–50, 2003. Disponível em: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/574. Acesso em: 29 mar. 2024.

Chicago

Díaz M., Marcela, Diego A. Fajardo, José Dilmer Moreno, Celsa García, y Víctor M. Núñez. 2003. «Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa». Revista Colombiana De Biotecnología 5 (2):40-50. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/574.

Harvard

Díaz M., M., A. Fajardo, D., Moreno, J. D., García, C. y Núñez, V. M. (2003) «Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa», Revista Colombiana de Biotecnología, 5(2), pp. 40–50. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/574 (Accedido: 29 marzo 2024).

IEEE

[1]
M. Díaz M., D. A. Fajardo, J. D. Moreno, C. García, y V. M. Núñez, «Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa», Rev. colomb. biotecnol., vol. 5, n.º 2, pp. 40–50, jul. 2003.

MLA

Díaz M., M., D. A. Fajardo, J. D. Moreno, C. García, y V. M. Núñez. «Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa». Revista Colombiana de Biotecnología, vol. 5, n.º 2, julio de 2003, pp. 40-50, https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/574.

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Díaz M., Marcela, Diego A. Fajardo, José Dilmer Moreno, Celsa García, y Víctor M. Núñez. «Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa». Revista Colombiana de Biotecnología 5, no. 2 (julio 1, 2003): 40–50. Accedido marzo 29, 2024. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/574.

Vancouver

1.
Díaz M. M, A. Fajardo D, Moreno JD, García C, Núñez VM. Identificación de Genes R1 y R2 que confieren resistencia a Phytophthora infestans en genotipos colombianos de papa. Rev. colomb. biotecnol. [Internet]. 1 de julio de 2003 [citado 29 de marzo de 2024];5(2):40-5. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/574

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