Estudios preliminares en la estandarización de un protocolo para la obtención de callos embriogénicos en dos clones de caucho (Hevea brasiliensis Müll. Arg.) de diferentes orígenes geográficos

Premilinary studies for optimiziing a protocol for obtaining embryogenic calluses in two rubber (Hevea brasiliensis Mull. Arg) clones from different geographical origins

Se investigó la influencia de los reguladores de crecimiento para la obtención de callos friables en caucho (Hevea brasiliensis Müll. Arg.) sin llegar a obtenerse regeneración de plántulas. En todos los ensayos realizados en este estudio, se utilizaron dos clones de diferentes orígenes geográficos: el FX 3864 (suramericano) y el PB 254 (asiático). Para los diferentes tratamientos se utilizaron como explantes hojas jóvenes e integumento de semillas de ocho a diez semanas de edad de ambos clones, los cuales se cultivaron inicialmente en los medios MH (Carron, et ál., 1989), MH modificado (Montoro, et ál., 1993, 2000) y el MS modificado (Carron, et ál., 1992), sin obtener ninguna respuesta a los 25 y a los 50 días. Sin embargo, se realizaron otros ensayos con el integumento en el medio de cultivo MS (Murashige and Skoug,1962) modificado con la adición de 0.67 mg/L de BAP y 0.66 mg/L de 2-4 D, como medio para la iniciación de embriogénesis, observándose a los 25 días la formación de callos friables y de color blanco, en los dos clones seleccionados. Estos callos fueron subcultivados en medio MS (1962) suplementado con 0.35 mg/L de BAP y 0.2 mg/L de 2-4 D como medio de expresión de callogénesis, observando a los 50 días expresión embriogénica en ambos clones. Igualmente se obtuvo callo friable de color blanco a partir de hojas jóvenes en los dos clones en medio de cultivo MS suplementado con 1.0 mg/L de BAP, 1.0 mg/L de ANA pero sin IBA y kinetina a los 25 días. Callos subcultivados en el mismo medio suplementado con 0.5 mg/L de BAP y 0.5 mg/L de ANA, presentaron una mejor consistencia de callo friable después de 50 días de cultivo. Este trabajo es un informe parcial de un macroproyecto sobre la optimización de un protocolo para la multiplicación de caucho (Hevea brasiliensis) vía embriogénesis somática.

The influence of growth regulators on obtaining friable rubber (Hevea brasiliensis Müll. Arg.) calluses with no plant regeneration as investigated. Two clones having different geographical origin were used in all trails carried out in this study: FX 3864 (South-American) and PB 254 (Asian). Young leaves and eight- to ten-week-old seed integument from both clones were used as explants in several experiments; they were initially cultured in MH medium (Carron, et ál., 1989), modified MH medium (Montoro, et ál., 1993, 2000) and modified MS medium (Carron, et at,. 1992), no positive response being obtained by days 25 or 50. However, other trials were carried out with the integument in modified MS medium (1962), 0.67 mg/L BAP and 0.66 mg/L 2-4 D being added as medium for initiating embryogenesis, the formation of white, friable calluses being observed by day 25 in the two selected clones. These calluses were sub-cultured in MS supplemented with 0.35 mg/L BAP and 0.2 mg/L 2-4 D as callogenesis expression medium, embryogenic expression being observed in both clones by day 50.

Equally friable white calluses were obtained from young leaves in the two clones in MS medium supplemented with 1.0 mg/L BAP, 1.0 mg/L ANA but without IBA and kinetin by day 25. Calluses sub-cultured in the same medium supplemented with 0.5 mg/L BAP and 0.5 mg/L ANA began to show increased friability after 50 days. culture. This work is a partial report of a macro-project for optimising a protocol for rubber (Hevea brasiliensis)  multiplication by somatic embryogenesis.

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	Estudios preliminares en la estandarización de un protocolo para la obtención de callos embriogénicos en dos clones de caucho (Hevea brasiliensis Müll. Arg.) de diferentes orígenes geográficos Preliminary studies for optimizing a protocol for obtaining embryogenic calluses in two rubber (Hevea brasiliensis Müll. Arg. ) clones from different geographical origins Santiago Cadavid Ruiz', César Augusto Hernández Rendórí, Rodrigo Hoyos S." Marisol Medina S."~, Luis Fernando Restrepo"" RESUMEN Se investigó la influencia de los reguladores de crecimiento para la obtención de callos friables en caucho (Hevea brasiliensis Müll. Arg.) sin llegar a obtenerse regeneración de plántulas. En todos los ensayos realizados en este estudio, se utilizaron dos clones de diferentes orígenes geográficos: el FX 3864 (suramericano) y el PB 254 (asiático). Para los diferentes tratamien­tos se utilizaron como explantes hojas jóvenes e integumento de semillas de ocho a diez semanas de edad de ambos clones, los cuales se cultivaron inicialmente en los medios MH (Carrón, et ál., 1989), MH modificado (Montoro, et ál., 1993, 2000) y el MS modificado (Carrón, et ál., 1992), sin obtener ninguna respuesta a los 25 y a los 50 días. Sin embargo, se realizaron otros ensayos con el integumento en el medio de cultivo MS (Murashige and Skoug,1962) modificado con la adición de 0.67 mg/L de BAP y 0.66 mg/L de 2-4 D, como medio para la iniciación de embriogénesis, observándose a los 25 días la forma­ción de callos friables y de color blanco, en los dos clones seleccionados. Estos callos fueron subcultivados en medio MS (1962) suplementado con 0.35 mg/L de BAP y 0.2 mg/L de 2-4 D como medio de expresión de callogénesis, observando a los 50 días expresión embriogénica en ambos clones. Igualmente se obtuvo callo friable de color blanco a partir de hojas jóvenes en los dos clones en medio de cultivo MS suplementado con 1.0 mg/L de BAP, 1.0 mg/L de ANA pero sin IB A y kinetina a los 25 días. Callos subcultivados en el mismo medio suplementado con 0.5 mg/L de BAP y 0.5 mg/L de ANA, presentaron una mejor consistencia de callo friable después de 50 días de cultivo. Este trabajo es un informe parcial de un macroproyecto sobre la optimización de un protocolo para la multiplicación de caucho (Hevea brasiliensis) vía embriogénesis somática. Palabras clave: Hevea brasiliensis, iniciación de callogénesis, callo friable, cultivo in vitro, caucho natural. ABSTRACT The influence of growth regulators on obtaining friable rubber (Hevea brasiliensis Müll. Arg.) calluses with no plant regeneration was investigated. Two clones having different geographical origin were used in all trails carried out in this study: FX 3864 (South-American) and PB 254 (Asian). Young leaves and eight- to ten-week-old seed integument from both clones were used as explants in several experiments; they were initially cultured in MH médium (Carrón, et ál., 1989), modified MH médium (Montoro, et ál., 1993, 2000) and modified MS médium (Carrón, et at,. 1992), no positive response being obtained by days 25 or 50. However, other triáis were carried out with the integument in modified MS médium (1962), 0.67 mg/L BAP and 0.66 mg/L 2-4 D being added as médium for initiating embryogenesis, the formation of white, friable calluses being observed by day 25 in the two selected clones. These calluses were sub-cultured in MS supplemented with 0.35 mg/L BAP and 0.2 mg/L 2-4 D as callogénesis expression médium, embryogenic expression being observed in both clones by day 50. Equally friable white calluses were obtained from young leaves in the two clones in MS médium supplemented with 1.0 mg/L BAP, 1.0 mg/L ANA but without IBA and kinetin by day 25. Calluses sub-cultured in the same médium supplemented with 0.5 mg/L BAP and 0.5 mg/L ANA began to show increased friability after 50 days' culture. This work is a partial report of a macro-project for optimising a protocol for rubber (Hevea brasiliensis) multiplication by somatic embryogenesis. Key words: Hevea brasiliensis, callogénesis initiation, friable calli, in vitro culture, natural rubber. Recibido: agosto 10 de 2004. Aceptado: noviembre 20 de 2005
	* Ingeniero agropecuario y biólogo MSc. Escuela de Ciencias Agrarias. Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Medellín, Colombia. Tel. (4) 466 37 34, (4) 454 09 99 ext. 102. Correo electrónico: cesaraugu@une.net.co ** MSc, PhD. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional, sede Medellín, Tel.: 430 91 02, Correo electrónico: rhoyos@unalmed.edu.co *** MSc. y Especialista. Escuela de Producción Agropecuaria. Universidad de Antioquia. Medellín. Tel.: 425 91 48. Correo elec­trónico: solmedina@agronica.udea.edu.co, frbstatistical@yahoo.com.es
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	ESTUDIOS PRELIMINARES EN LA ESTANDARIZACIÓN DE UN PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGENICOS
	INTRODUCCIÓN El uso del cultivo de caucho (Hevea brasiliensis) como recuperador de suelos y como sumidero de CO2, crea un impacto ecológico de sostenibilidad, por cuanto mejora la calidad ambiental colaborando con el restablecimiento del equilibrio agua - aire -suelo - seres vivos. El uso de técnicas biotecnológi-cas y la globalización del mercado, han ayudado a la optimización de la producción del caucho en otros países principalmente en Asia y Europa, con el pro­pósito de responder a las necesidades del mercado, haciØndolo rentable y competitivo. Sin embargo, no se han estandarizado las tØcnicas de siembra y de extracción del caucho, y además, no se han hecho las innovaciones tecnológicas pertinentes. En Co­lombia, aœn se emplea material vegetal introducido hace mÆs de 35 aæos. Estos aspectos son relevan­tes en la heveicultura, ya que Østa presenta alta demanda de tecnología, especialmente cuando se requiere establecer plantaciones con altos niveles de producción y obtener caucho de óptima calidad que haga de ella una actividad competitiva. El esta­blecimiento de las plantaciones del Ærbol del caucho mediante propagación tradicional, presenta gran­des limitaciones. Para solucionar este problema, se recurre entonces a la embriogØnesis somÆtica como una herramienta alternativa de obtención de árbo­les a mediano plazo. A partir de los aæos sesenta, se emprendieron investigaciones para poner a punto la embriogØnesis somÆtica en caucho (Hevea brasiliensis Müll. Arg.) y en otros cultivares de interØs comercial. Como la mayoría de las especies leñosas el Hevea fue en un principio reportado como recalcitrante para el cultivo in vitro. DespuØs de varios aæos de investi­gaciones, se han regenerado vitroplantas de varios clones de interØs industrial (Carron, et Æl., 1998). Estudios realizados por Michaux-Ferriére and Carron, 1989; Montoro, et Æl., 1992; Carron, et Æl., 1992; Carron, et Æl., 1993; Etienne, et Æl., 1993a; Montoro, et Æl., 1993; Veisseire, et Æl.,1994a; Montoro, et Æl., 1994; Carron, et Æl., 1995a y 1995b; Carron, et Æl., 1998, han aplicado con Øxito la tØcni­ca de embriogØnesis somÆtica en Hevea brasiliensis a partir del integumento de la semilla, mediante la adición al medio Murashige Skoog, 1962 de dife­rentes tipos de auxinas y citoquininas previamente balanceadas, hasta el punto de tener actualmente	plantas sembradas en campo con excelente pro­ducción y en un tiempo mucho más corto comparado con las plantas obtenidas mediante re­producción tradicional. Igualmente en estudios realizados por Leitao, et Æl., 1998, mediante embriogØnesis somÆtica se obtuvieron callos embriogénicos utilizando como explante hojas jó­venes de Hevea brasiliensis. Con el presente trabajo se pretende evaluar el efecto de los reguladores de crecimiento BAP, K, ANA, IBA y 2-4D sobre tejidos jóvenes de hojas e integumento, como un estudio preliminar que per­mita estandarizar un protocolo para la obtención de callos embriogØnicos de dos clones de caucho de diferentes orígenes geográficos, como parte de otros trabajos de investigación en la misma línea. MATERIALES Y MÉTODOS Localización. El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Crecimiento y Desarrollo de las Plan­tas de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Selección del material vegetal. El material vege­tal se obtuvo de dos clones de caucho con características diferentes: el FX 3864 originario de SuramØrica considerado tolerante a ciertas enfer­medades como al hongo Microcyclus ulei (que produce el mal suramericano de las hojas) y al Colletotrichum sp (que ocasiona la antracnosis en diferentes partes de la planta); y el clon PB 254, originario del continente asiÆtico y considerado al­tamente productor de lÆtex, ubicados en la subestación Paraguaicito propiedad de CENICAFÉ, municipio de Armenia, departamento del Quindío, Colombia. Los clones fueron seleccionados de acuerdo con los resultados del estudio de compor­tamiento referente a la resistencia a enfermedades y a la producción de látex de ambos clones respec­tivamente, con base en los estudios realizados por López (1998). Obtención de explantes. Los explantes que se eva­luaron en este estudio, fueron hojas jóvenes y el integumento de la semilla. Los explantes de hojas jóvenes, se obtuvie­ron de estacas de 50 a 80 cm de longitud y 5 a 10
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	cm de diÆmetro. Las estacas se mantuvieron en condiciones de invernadero en la Universidad Na­cional de Colombia, sede Medellín, en condiciones adecuadas para su desarrollo. Los explantes del tejido de integumento, se obtuvieron a partir de frutos inmaduros (entre 8 a 10 semanas despuØs de la antesis) de los clones seleccionados, el cual tiene la característica de ser un tejido materno que posee el mismo genotipo de la planta madre, es estØril por naturaleza y no re­quiere de desinfección antes de cultivarlo in vitro (Carron y Enjalric, 1995b). Desinfección de los explantes. Las hojas jóve­nes se lavaron con abundante agua y jabón líquido comercial, y posteriormente se colocaron en alco­hol al 70% por 30 segundos, luego se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 2% con 2 gotas de tween 80 en 100 mL de solución durante 10 min., para lavarlos finalmente 4 a 5 veces con agua destilada estØril. Para la obtención del tejido de integumento la semilla se desinfectó externamente sumergiéndo­la en hipoclorito de sodio al 5% por 10 minutos flameÆndola posteriormente con alcohol. El integumento se extrajo en condiciones estØriles en la cÆmara de flujo laminar horizontal (Carron, et Æl., 1989). Medios de cultivo para la inducción de callos embriogØnicos. Se evaluaron tres medios des­critos en la literatura los cuales tienen como base el medio Murashige y Skoog (MS) (1962), estos fueron: el medio MH (Carron, et Æl., 1989), el me­dio MH modificado (Montoro, et Æl., 1993, 2000) y el medio MS modificado (Carron, et ál., 1992), em­pleados por los investigadores anteriormente mencionados para la inducción de embriones a partir del integumento en los clones PB 254 y FX 3864 (tabla 1). Después de 25 días, los explantes que formaron callo se transfirieron a los mismos medios reduciendo la concentración tanto de auxinas como de citoquininas en condiciones de oscuridad. Adicionalmente, se realizaron dos ensayos di­ferentes a los reportados por la literatura, uno con el integumento interno y otro a partir de hojas jóvenes:	Efecto del 2-4D y BAP en la iniciación de callos friables en el tejido de integumento. Con el pro­pósito de evaluar y comparar la efectividad del medio MS con los tres medios descritos anterior­mente, éste se suplemento con diferentes concentraciones de Æcido 2-4 diclorofenoxiacØtico (2-4D) y 6- bencilaminopurina (BAP). Como explante se utilizó el integumento de la semilla de los clones FX 3864 y PB 254 para la iniciación y formación de callogénesis realizando lecturas a los 25 y 50 días en condiciones de oscuridad. Efecto de la kinetina y el BAP en la iniciación de callos friables en el tejido de hoja joven. Se sem­braron segmentos de hojas jóvenes de aproximadamente 1.0 cm2 de los clones FX 3864 y PB 254 en frascos con medio MS suplementado con BAP, kinetina (K), Æcido naftalenacØtico (ANA) y ácido indol butírico (IBA) con diferentes concen­traciones, mÆs 80 g/L de sacarosa y a pH 5.8 en condiciones de oscuridad, con el fin de obtener ca­llos friables realizando lecturas a los 25, 50 y 80 días, utilizando la metodología propuesta por Leitao, et Æl., 1998. Diseæo experimental Se empleó un diseño experimental completamente aleatorizado, efectos fijos, balanceado, simØtrico con un arreglo factorial 23 y 24, donde la variable respuesta fue el conteo de callos. Se empleó una transformación basada en la familia Box- Cox, con el propósito de convalidar algunos de los supues­tos asociados con el anÆlisis de la varianza. Se utilizó la prueba de comparación por el método de Tukey al 5% de significancia con el propósito de comparar el efecto promedio de los distintos trata­mientos sometidos a experimentación. Para todos los tratamientos realizados en este estudio se hicieron 10 rØplicas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Evaluación de los medios MH (Carrón, et ál., 1989), MH modificado (Montoro, et Æl., 1993, 2000) y el MS modificado (Carron, et ál, 1992) para la iniciación y formación de callos embriogØnicos. El callo se inicia por la prolifera­ción de células en el punto de corte del explante o
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	Tabla 1. Composición de los medios de cultivo MH (Carrón, et ál., 1989), MH modificado (Montoro, et ál., 1993, 2000) y el MS modificado (Carrón, et ál., 1992).
	Compuestos MH (Carrón, 1989) MH Modificado MS Modificado (mg/L) (Montoro, 1993, 2000) (Carrón, etál., 1992) (mg/L) (mg/L) NH4NO3 1601 1601 1650 KNO3 2022 2022 1900 CaCI2 333 1330 CaCI2 2H2O: 440 MgSCy7H2O 739 739 370 NaH2PCyH2O 276 276 H3BO3 9.28 9.28 6.2 MnSCy4H2O 16.9 16.9 MnSO4 H2O: 22.3 ZnSCy7H2O 11.5 11.5 8.6 CuSCy5H2O 0.37 0.37 0.25 Na2MoCy2H2O 0.24 0.24 0.25 KI 0.83 0.83 0.83 CoCI2-6H2O 0.24 0.24 0.25 NaSO4 92.37 92.37 Mioinositol 5.40 5.40 100 Ácido Nicotínico 0.46 0.46 0.5 Piridoxina HCl 0.62 0.62 0.5 Tiamina HCl 0.67 0.67 0.1 Biotina 0.048 0.048 D- Pantotenato de Calcio 0.48 0.48 Ácido Ascórbico 0.17 0.17 Cloruro de Colina 0.14 0.14 L-Cisteína HCl 0.46 0.46 Glicina 0.37 0.37 Riboflavina 0.37 0.37 Sacarosa 80 g/L 75 g/L 80 g/L Bacto Agar Difco 7.2 g/L Gelrite: 2 g/L Gelrite: 2g/L PH 5.8 5.8 5.8 AIA 1.0 2-4 D 0.3 3-4 D: 1.0 3-4 D: 2.0 BAP (opcional) 1-5 kinetina: 1.0 AgNO3: 5.0 1.7 FeSO4.7H2O: 27.8 Na2EDTA.2H2O: 37.3 KH2PO4: 170
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	en la superficie interna del integumento (cerca de la nucela) y tambiØn a partir de cØlulas perivasculares (Michaux- FerriØre y Carron, 1989). En los tres medios anteriormente menciona­dos a los 25 días de cultivo y en condiciones de oscuridad, se obtuvieron callos compactos, y de color blanco; posteriormente estos callos se subcultivaron en medio fresco con las concentra­ciones de 2-4D, AIA y BAP reducidas a la mitad. Después de 50 días de cultivo no se presentó nin­gún cambio, es decir, no manifestaron expresión embriogØnica. En estudios realizados por Montoro, et Æl., (1993), encontraron un comportamiento simi­lar del integumento cuando se sembró en el medio Carron (1989). Solamente dos de cinco clones eva­luados fueron capaces de formar espontÆneamente una cantidad moderada de callos friables, los otros clones formaron callos compactos. Segœn Ettiene et Æl., (1993b), el anÆlisis que se puede hacer de la influencia de los reguladores de crecimiento en el cultivo in vitro generalmente se ve alterado debido a que es muy poco lo que se conoce sobre el grado de absorción, migración y metabolismo de estos elementos vía embriogénesis somÆtica. Algunos investigadores, tales como Hess y Carman (1991); Li y Neumann (1985) y Rajasekaran, et Æl., (1987), citados por Ettiene (1993b), reportan que los tejidos embriogØnicos son muy ricos en Ácido Abscísico (ABA), mientras que el contendido de Ácido 3- Indol Acético (AIA) varía con­siderablemente de una especie a otra. La adquisición de la capacidad embriogénica de los callos puede estar relacionada con el establecimien­to de un balance específico entre diferentes hormonas de tipo endógeno. La manifestación de callos duros, pequeæos y de color blanco entre los 15 a los 50 días, y su permanencia en este estado, posiblemente estÆ relacionada con el rompimiento de este balance hormonal. Estudios realizados por Carron, et Æl., (1998) a partir de integumento, mostraron que en el medio para la iniciación de callogénesis, la adición de sus­tancias tales como calcio, sacarosa y fitohormonas, permiten estimular la formación de lóbulos friables en los callos. AdemÆs, comenta el mismo autor, se deben realizar entre 4 a 6 subcultivos en el mismo medio de iniciación, para estimular la formación de	callos friables e inhibir al mismo tiempo la manifes­tación temprana de la embriogénesis somática. Igualmente, establecieron que la calidad de tejido friable no es un carÆcter œnico y suficiente para definir una completa embriogØnesis, tambiØn es preciso que el callo adquiera una fuerte capacidad de proliferación. En esta investigación solamente se realizó un subcultivo a los 26 días en los tres medios evaluados, lo cual puede considerarse como una de las causas para que los callos obtenidos no mostraran proliferación ni estructura friable (figura 1). Adicionalmente, la respuesta dada por los clones difiere de las obtenidas por los medios reportados en la literatura, posiblemente esto se deba a que en estos estudios utilizaron los clones PR 170 y PB 250 obteniendo embriogØnesis somÆtica reprodu-cible, mientras que en este trabajo se evaluaron los clones FX 3864 y PB 254 siendo genotipos dife­rentes.
		Figura 1. Callo de estructura y apariencia compacta obte­nido con los tres medios evaluados.
		Para este ensayo se considera que los genotipos de los dos clones seleccionados tienen incidencia en los resultados. El integumento de la semilla de los clones PB 254 y FX 3864 no mostró capacidad para la generación de callo tipo embriogénico, ni para la formación de líneas de ca­llos friables proliferantes. En trabajos realizados por Carron, et Æl (1998), utilizando 12 genotipos dife­rentes, encontraron que la mitad de los genotipos no mostraron capacidad para la formación de callo a partir de integumento, en cambio, con los otros seis se lograron embriones somÆticos y de manera reproducible.
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	El uso de agentes inhibidores de la acción del etileno como el AgNO3, ha sido reportado como un inductor de la embriogØnesis somÆtica (Carron, 1995a). El efecto inhibitorio es causado por la ocu­pación de los sitios de acción del etileno en la célula por el ion plata (Ag+). La diferente respuesta de los medios de cultivo reportados en la literatura con los obtenidos en este trabajo para la produc­ción de callo embriogénico, posiblemente esté relacionada con el uso de diferentes clones en ambos estudios, y que ademÆs es probable que los materiales utilizados en este estudio no nece­siten de un agente protector contra la acción del etileno. Efecto del 2-4D y BAP en la iniciación de callos friables en el tejido de integumento. El efecto de las hormonas para la producción de callos se eva­luó en el medio MS para los clones PB 254 y FX 3864, a partir del integumento de la semilla, tal y como se muestra en las tablas 2 y 3, donde cada tratamiento se denota entre parØntesis. El efecto de las concentraciones hormonales sobre la inicia­ción de la callogénesis se presentó a los 25 días tanto para el clon PB 254 como para el FX 3864. El tipo de callo observado para ambos clones, tuvo una apariencia de color blanco y aspecto friable. De la misma manera el nœmero de callos obtenidos parar ambos clones con los mismos tratamientos fue muy similar (tablas 2 y 3). La respuesta del clon PB 254 con relación a la variable nœmero de callos de acuerdo con el ANAVA	(tabla 4), mostró diferencias altamente significati­vas (P< 0.01) entre las dosificaciones de 2-4 D de la siguiente manera: existió diferencia entre la con­centración de 0.66 mg/L con respecto a la de 0.88 mg/L y al tratamiento testigo, al igual que entre la concentración de 0.44 mg/L con respecto a la de 0.88 mg/L y al testigo, (P<0.05), pero no se encon­traron diferencias entre la concentración de 0.66 mg/L y la de 0.44 mg/L, ni entre la de 0.88 mg/L y el tratamiento testigo (P>0.05) (tabla 5). Se deduce que la mejor dosificación para la producción de ca­llo del factor 2-4 D al compararla con las demÆs dosificaciones del mismo factor, fue 0.66 mg/L y la mÆs baja la de 0 mg/L (testigo). Para las dosis evaluadas de BAP se encon­traron diferencias significativas entre 0.67 mg/L y el tratamiento testigo, entre 0.67 mg/L y 0.88 mg/L, y entre las dosis de 0.44 mg/L y el testigo y 0.44 mg/ L y 0.88 mg/L (P<0.05); entre las demÆs no hubo diferencia (P>0.05). Por tanto, la mejor dosificación individual para el factor BAP para la producción de callo fue la de 0.67 mg/L (tabla 6). Este mismo anÆ­lisis se presentó en el clon FX 3864. Con base en este análisis estadístico se pue­de establecer que el tratamiento nœmero 11 (0.66 mg/L de 2-4 D y 0.67 mg/L de BAP) realizado para ambos clones (tablas 2 y 3), fue el que presentó mayor nœmero de callos 6 para el clon de origen asiÆtico, que corresponde al 60% de los callos ob­tenidos, y 5 (el 50%) en el clon de origen suramericano.
	Tabla 2. Nœmero de callos obtenidos con diferentes concentraciones de BAP y 2-4D a partir del tegumento interno del clon PB 254 a los 25 días
	2-4D mg/L BAP mg/L 0 0.44 0.67 0.98 0 Testigo (1) 0 (2) 0 (3) 0 (4) 0.44 0 (5) 4 (6) 4 (7) 3 (8) 0.66 0 (9) 4 (10) 6 (11) 4 (12) 0.88 0 (13) 2 (14) 1 (15) 0 (16)
	Cada tratamiento se muestra entre parØntesis.
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	Tabla 3. Nœmero de callos obtenidos con diferentes concentraciones de BAP y 2-4D a partir de tegumento interno del clon FX 3864 a los 25 días
	2-4D mg/L BAP mg/L 0 0.44 0.67 0.98 0 Testigo (1) 0 (2) 0 (3) 0 (4) 0.44 0 (5) 3 (6) 3 (7) 3 (8) 0.66 0 (9) 4 (10) 5 (11) 3 (12) 0.88 0 (13) 2 (14) 0 (15) 0 (16)
	Cada tratamiento se muestra entre parØntesis.
	Tabla 4. Análisis de varianza para la producción de callos a los 25 días en el clon PB 254
	Fuente de variación Grados de libertad Suma de cuadrados Cuadrado medio F (calculado) Valor P 2-4 D BAP 2-4 D- BAP 3 3 9 0.87083488 0.49570601 0.37512887 0.29027829 0.16523534 0.04168099 9.40 5.35 1.35 0.0001 0.0016 0.2168
	Tabla 5. Prueba de comparación de Tukey (a= 0.05) para la producción de callos a los 25 días en el factor 2-4 D.
	Dosis de 2-4 D Media (datos transformados) Media de datos Simbología Tukey* 0.66 0.8883 1.2890 A 0.44 0.8495 1.2217 A 0.88 0.7459 1.0564 B 0 0.7071 0.5000 B
	Letras distintas muestran diferencia estadística.
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	Tabla 6. Prueba de comparación de Tukey (a= 0.05) para la producción de callos a los 25 días en el factor BAP.
	Dosis de BAP Media (datos transformados) Media de datos Simbología Tukey* 0.67 0.8883 1.2890 A 0.44 0.8495 1.2217 A 0.88 0.7459 1.0564 B 0 0.7071 0.5000 B
	* Letras distintas muestran diferencia estadística.
	También se observó con base en los análisis estadísticos, que aunque el tratamiento número 11 (0.67 mg/l de BAP y 0.66 mg/L de 2-4D) para el clon PB 254, fue en el que mayor nœmero de callos se produjeron (60%), este tratamiento no presentó diferencias significativas con los tratamientos 6 (0.45 mg/L de BAP y 0.44 mg/L de 2-4D), 7 (0.67 mg/L de BAP y 0.44 mg/L de 2-4D) y 10 (0.45 mg/L de BAP y 0.66 mg/L de 2-4D) (figura 2); en el clon FX 3864 igualmente se presentó que los mismos tratamien­tos fueron los mejores para la iniciación de la callogØnesis, siendo el tratamiento 11 igualmente, el que mayor número de callos presentó con un to-	tal de cinco (el 50%) de 10 explantes sembrados por tratamiento. Segœn Montoro, et ál., (1993), el color cafØ de los callos estÆ directamente relacionado con la adi­ción de kinetina al medio de cultivo, lo cual nos lleva a considerar que posiblemente el color blanco de los callos obtenidos en este estudio a los 25 días, pueda estar relacionado con la presencia de BAP en el medio de cultivo. Con el propósito de evaluar el desarrollo embriogØnico de los callos obtenidos, los dos clones
	Tratamientos Figura 2. Nœmero de callos obtenidos con diferentes concentraciones de 2-4D y BAP a los 25 días en el clon PB 254.
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	Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. VIII N° 1 Julio 2006 32-47
	se subcultivaron en medio fresco con una concen­tración hormonal reducida a la mitad tanto de 2-4D como de BAP. Estos callos después de 50 días con­tinuaron con la misma textura friable y mantuvieron la misma coloración, sin embargo, unos pocos pre­sentaron tendencia a callos embriogØnicos tal y como los describió Carrón, etál., 1995a. Solamente un ca­llo procedente de tejido de integumento del clon PB 254 presentó estructura más desarrollada (figura 3). De los trabajos consultados para este estu­dio, muy pocos tienen como base para la iniciación de la callogØnesis el medio MS suplementado con diferentes concentraciones de 2-4D y BAP; sin embargo, Wang, et ál., (1980), y Chen, et Æl., (1981, 1982), utilizando anteras como explantes iniciales, las sembraron en las sales de MS y de Wang, et ál., (1980) suplementadas con 2-4D y BAP, resul­tando callos embriogØnicos, los cuales fueron inducidos a producir embriones y Østos a su vez, fueron sometidos a un proceso de conversión para producir plÆntulas. El- Hadrami, and I.D1 Auzac (1992), compara­ron diferentes concentraciones de 2-4 D y BAP, y observaron que el suministro de estos reguladores de crecimiento mejora el potencial embriogØnico comparado con el medio control, en el cual no es­taban presentes ambas hormonas, lo cual posiblemente nos lleva a considerar que tanto el BAP como el 2-4D no sean endógenos en los clones evaluados. De acuerdo con Carron, et ál., (1995a) los tipos de reguladores de crecimiento y sus concen­traciones son parÆmetros esenciales para el desarrollo del callo. Ettiene, et Æl., (1991) y Carron,	et ál., (1995b), demostraron que aunque la adi­ción de kinetina y BAP en el medio de cultivo puede oscurecer el color de los callos en el medio de in­ducción de callogénesis, ambos reguladores promueven la inducción de la embriogénesis somática y la posterior conversión de de los em­briones a plÆntulas. Michaux- Ferriere y Carron (1989), igualmen­te encontraron el mismo tipo, tamaæo textura y color en los callos entre los 15 a los 40 días, a los repor­tados en el presente estudio. DespuØs de los 90 días observaron muy pocos proembriones lo cual se debe a que las cØlulas embriogØnicas se origi­nan ocasionalmente y a largo plazo despuØs de la desdiferenciación celular. Montoro, et Æl., (1992), establece que las auxinas juegan un papel muy importante en el de­sarrollo de embriones somÆticos, pero igualmente manifiesta que las citoquininas interactœan con las auxinas en la regulación de la ontogénesis de los embriones. Los resultados obtenidos en el presente tra­bajo en cuanto al tipo de callo obtenido al usar una relación hormonal de auxina y citoquinina (2-4 D y BAP respectivamente), coinciden con los estudios realizados por Carron (1989), Montoro (1993 y 2000), y Carron, et ál., (1992) con otros clones. Estudios de tipo histológico realizados por Michaux- Ferriere y Carron (1989), mostraron que entre los días 15 a 40, los callos son ricos en célu­las polifenólicas lo cual impide su potencial de multiplicación ocasionando la dureza, cambio de color y baja tasa de crecimiento del callo; a partir
	Figura 3. Embriones somáticos obtenidos a partir de integumento del clon PB 254 a los 50 días
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	ESTUDIOS PRELIMINARES EN LA ESTANDARIZACIÓN DE UN PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGÉNICOS
	del día 40 los callos generalmente se vuelven necróticos debido a los diferentes subcultivos que se hacen y al desbalance entre auxinas y citoquininas en el medio de cultivo. Esto hace su­poner que el tipo de callo encontrado en este trabajo, corresponda a callos friables embriogØnicos dada la coincidencia en la descripción que hacen estos autores. Sin embargo, en este estudio los callos obtenidos a partir de integumento presentaron un tejido mÆs compacto. Se considera que la callogØnesis depende del tipo de clon, del tipo de explante y de las condiciones experimentales se­leccionadas, las cuales podrían ser las causas principales de la morfología de los callos obtenidos en los medios evaluados en este estudio para los dos genotipos seleccionados. Carron, et Æl., (1992), encontraron que duran­te la fase de iniciación de callos embriogénicos después del día 15, se producen altas cantidades de gases principalmente de CO2, lo cual tiene un efecto negativo sobre el desarrollo y mantenimien­to de la callogØnesis. Los mismos autores mencionan que el tipo de agar utilizado para la iniciación de la callogØnesis tambiØn es un parÆmetro importan­te, e incide en aspectos como la estructura, el color		y el potencial embriogØnico del callo. Encontraron que Gelrite contiene una composición apropiada de sustancias sin efectos inhibitorios para el de­sarrollo del callo, el cual igualmente fue utilizado en este estudio. Efecto de la kinetina y el BAP en la iniciación de callos friables en el tejido de hoja joven. Son muy pocos los trabajos en caucho (Hevea brasiliensis) en los cuales se ha reportado la obten­ción de callos embriogénicos a partir de hoja joven como explante inicial. Para la obtención de callo a partir de hojas jóvenes de los clones PB 254 y FX 3864, se utilizó el medio MS (1962) suplementado con diferentes concentraciones de auxinas y citoquininas, tal y como se observa en las tablas 7 y 8. El análisis estadístico tanto para el clon PB 254 como para el FX 3864 mostró diferencias sig­nificativas (P<0.05) entre las dosificaciones de BAP siendo la mejor concentración 1.0 mg/L, seguida del testigo. Las concentraciones de 2.0 y 3.0 mg/L se mostraron como las mÆs bajas para la variable producción de callos. Sin embargo, se presentó di­ferencia estadística entre 1.0 mg/L de BAP con respecto a 2.0 mg/L y a 3.0 mg/L de la misma hor-
	Tabla 7. Nœmero de callos obtenidos con diferentes concentraciones de BAP, K, ANA e IBA a partir de hojas jóvenes del clon PB 254 a los 25 días kinetina mg/L
	BAP mg/L	0 1 CNI 3 0 Testigo (1) CNI (2) 0 (3) 2 (4) 0 1 6 (5) CNI (6) 0 (7) 0 (8) 1 2 0 (9) 0 (10) 0 (11) 0 (12) 2 3 0 (13) 0 (14) 0 (15) 0 (16) 3 0 1 CNI 3		ANA mg/L
	IBA mg/L
	Cada tratamiento se muestra entre parØntesis.
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	Tabla 8. Nœmero de callos obtenidos con diferentes concentraciones de BAP, K, ANA e IBA a partir de hojas jóvenes del clon FX 3864 a los 25 días (se realizaron 10 repeticiones por tratamiento) kinetina mg/L
	BAP mg/L	0 1 CNI 3 0 Testigo (1) 3 (2) 1 (3) 0 (4) 0 1 7 (5) 3 (6) 0 (7) 0 (8) 1 2 0 (9) 0 (10) 0 (11) 0 (12) 2 3 0 (13) 0 (14) 0 (15) 0 (16) 3 0 1 CNI 3		ANA mg/L
	IBA mg/L
	Cada tratamiento se muestra entre parØntesis.
	mona a favor de 1.0 mg/L, es decir, que altas dosis de BAP inhiben la formación de callos (P<0.05) (ta­blas 9 y 10). Concentraciones de 1.0 mg/L de ANA ayuda­ron a la formación de callos mostrando diferencias altamente significativas con concentraciones de 2.0 mg/L y 3.0 mg/L de esta hormona en las cuales no se presenta la inducción de callos friables (tablas 7 y 8). Para el efecto de la kinetina se encontraron diferencias significativas, mostrando en la prueba		de contraste de Tukey que la ausencia de kinetina favoreció el desarrollo de los callos seguida de 1.0 mg/L y de 3.0 mg/L; la concentración de 2.0 mg/L se considera que no favorece la inducción de ca­llos (tabla 11). Con base en este análisis estadístico se pue­de establecer que el tratamiento 5 (BAP 1 mg/L, y ANA 1 mg/L), tanto para el clon PB 254 como para FX 3864 después de 25 días de cultivo, fue el que presentó mayor número de callos, 6 y 7, que co­rresponde al 60% y 70% respectivamente. Se encontró que la apariencia de los callos se mejoró
	Tabla 9. Análisis de varianza para la producción de callos a los 25 días en el clon PB 254 a partir de hojas jóvenes
	Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F (calculado) Valor P variación libertad cuadrados medio BAP 3 0.29474411 0.09824804 7.33 0.0001 K 3 0.13397460 0.04465820 3.33 0.0213 BAP- K 9 0-61628314 0.06847590 5.11 0.0001
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	ESTUDIOS PRELIMINARES EN LA ESTANDARIZACIÓN DE UN PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGENICOS
	Tabla 10. Prueba de comparación de Tukey (a= 0.05) para la producción de callos a los 25 días en el factor BAP a partir de hojas jóvenes
	Dosis de BAP (mg/L) Media (datos transformados) Media de datos Simbología Tukey* 1 0.8106 1.1571 A 0 0.7589 1.0759 AB 2 0.7071 0.9999 B 3 0.7071 0.9999 B
	* Letras distintas muestran diferencia estadística.
	Tabla 11. Prueba de comparación de Tukey (a= 0.05) para la producción de callos a los 25 días en el factor kinetina a partir de hojas jóvenes
	Dosis de K (mg/L) Media (datos transformados) Media de datos Simbología Tukey* 0 0.7848 1.1159 A 1 0.7589 1.0759 AB 3 0.7330 1.0372 AB CNI 0.7071 0.9999 B
	* Letras distintas muestran diferencia estadística.
	cuando Østos fueron transferidos a medio fresco con las concentraciones de BAP y ANA reducidas a la mitad (0.5 mg/L y 0.5 mg/L respectivamente) (fi­gura 4). Contrario a lo reportado por Leitao, et Æl., (1998), la adición de kinetina y el incremento de BAP en el medio de cultivo, redujo la obtención de callos para los clones evaluados en este trabajo. Adicionalmente, con el 2-4D y el AlA no se logró la	producción de callos. Aunque no se logró obtener un callo embriogénico típico, ellos presentaron ca­racterísticas aparentes tal y como lo describió Carron (1995a), con explantes de integumento (fi­gura 5). CONCLUSIONES El efecto negativo de los medios de cultivo re­portados en la literatura para la producción de callo
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	Figura 4. Número de callos obtenidos con diferentes concentraciones de BAP, kinetina, ANA e IBA a los 25 días en el clon PB 254
	Figura 5. Callos friables obtenidos a partir de hojas jóvenes del clon PB 254 a los 50 días
	embriogØnico, pudo deberse a la respuesta varietal de los genotipos evaluados. Los clones FX 3864 y PB 254 utilizados en el presente estudio, respondieron de forma diferente a la producción de callos en los medios MS suple-mentado con 2-4D y BAP utilizando como explante el integumento, y en el medio MS con K, BAP, ANA e IBA a partir de hojas jóvenes como explante, sien­do el callo de tipo embriogØnico en el primer medio evaluado y friable en el segundo.	A partir de hojas jóvenes se obtuvieron callos friables, lo cual no había sido reportado en ningún trabajo consultado. AGRADECIMIENTOS Los autores expresan sus agradecimientos al Con­venio PolitØcnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid y la Universidad de Antioquia, a la Universidad Na­cional de Colombia sede Medellín, al ingeniero forestal Luis Fernando Medina, y a CENICAFÉ,
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	ESTUDIOS PRELIMINARES EN LA ESTANDARIZACIÓN DE UN PROTOCOLO PARA LA OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGENICOS
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