Publicado

2014-01-01

Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes

DOI:

https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.29420

Palabras clave:

estevia, esteviosido, micropropagación, reguladores de crecimiento vegetal, Stevia, stevioside, micropropagation, plant growth regulator (es)

Autores/as

  • Isidro Suárez Universidad de Córdoba
  • Irma R. Quintero Universidad del Magdalena

Título en ingles: Micropropagation of  Stevia rebaudiana Bertoni, a natural sweetener, through pre existing meristem explants 

Titulo corto: Micropropagación de Stevia rebaudiana Bertoni 

Resumen: Las hojas de Stevia rebaudiana son fuente de esteviosidos y rebaudiosidos, sustancias endulzantes con bajo contenido calórico. La propagación sexual y clonal de estevia es difícil debido a la calidad de la semilla y el tamaño reducido de la planta. Para evaluar la multiplicación, brotes establecidos in vitro fueron cultivados en ½ MS con cinco  concentraciones de BAP (0.0, 2.22, 4.44, 8.88 y 17.6 µM). Posteriormente, los tallos multiplicados se subcultivaron en presencia de cinco concentraciones de ANA (0.0, 2.69, 5.37, 10.74 de 21.48 µM) para evaluar enraizamiento. Finalmente, tallos multiplicados sin enraizar, tratados o no con 0.4% de ANA, y otros enraizados in vitro fueron transferidos a condiciones ex vitro. Todos los experimentos fueron distribuidos usando un DCA. Los resultados indicaron que el medio 1/2MS adicionado con BAP indujo una mayor tasa de multiplicación. 10.74 µM de ANA indujo el mejor enraizamiento; sin embargo, los tallos sin enraizamiento resultaron en la mayor supervivencia ex vitro.

Palabras clave: estevia, esteviosido, micropropagación, reguladores de crecimiento vegetal. 

Abstract: Stevia rebaudiana Bertoni leaves are source of stevioside and rebaudioside, non-caloric sweetener substances. Seed and cutting estevia propagation are difficult due to seed sterility and small size plant.  To evaluate shoot proliferation, in vitro-established estevia shoots were cultured in ½ MS with five (0.0, 2.22, 4.44, 8.88 and 17.6 µM) BAP levels.  Afterwards, proliferated shoots were cultured on ½ MS with five NAA levels (0.0, 2.69, 5.37, 10.74 and 21.48 µM) to evaluate shoot rooting.  Finally, non-rooted shoots, in vitro-rooted shoots and non-rooted shoots treated with a 0.4% NAA powder were transferred to ex vitro conditions.  All experiments were distributed using a complete randomized design. The data indicated that BAP treated shoots showed a higher rate of shoot proliferation.  An 87% of rooting and higher number of roots per explant was achieved with 10.74 µM of NAA.  Non-rooted shoots transferred directly from Stage II showed the best survival rate.

Key words: Stevia, stevioside, micropropagation, plant growth regulator.



ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes

Micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni, a natural sweetener, through pre existing meristem explants

Titulo corto: Micropropagación de Stevia rebaudiana Bertoni

Isidro E. Suarez1 y Irma R. Quintero2.

1 Universidad de Córdoba, Departamento de Ingeniería Agronómica y Desarrollo Rural, Carrera 6 No. 76-103. Montería-Colombia. isuarez@sinu.unicordoba.edu.co. Fax: (57-1) (4) 786 0255
2 MSc. Universidad del Magdalena. Carrera 32 No. 22 - 08. Santa Marta - Colombia.

Recibido: febrero 15 de 2013 Aprobado: abril 4 de 2014


Resumen

Las hojas de Stevia rebaudiana son fuente de esteviosidos y rebaudiosidos, sustancias endulzantes con bajo contenido calórico. La propagación sexual y clonal de estevia es difícil debido a la calidad de la semilla y el tamaño reducido de la planta. Para evaluar la multiplicación, brotes establecidos in vitro fueron cultivados en ½ MS con cinco concentraciones de BAP (0.0, 2.22, 4.44, 8.88 y 17.6 µM). Posteriormente, los tallos multiplicados se subcultivaron en presencia de cinco concentraciones de ANA (0.0, 2.69, 5.37, 10.74 de 21.48 µM) para evaluar enraizamiento. Finalmente, tallos multiplicados sin enraizar, tratados o no con 0.4% de ANA, y otros enraizados in vitro fueron transferidos a condiciones ex vitro. Todos los experimentos fueron distribuidos usando un DCA. Los resultados indicaron que el medio 1/2MS adicionado con BAP indujo una mayor tasa de multiplicación. 10.74 µM de ANA indujo el mejor enraizamiento; sin embargo, los tallos sin enraizamiento resultaron en la mayor supervivencia ex vitro.

Palabras clave: estevia, esteviosido, micropropagación, reguladores de crecimiento vegetal.

Abstract

Stevia rebaudiana Bertoni leaves are source of stevioside and rebaudioside, non-caloric sweetener substances. Seed and cutting estevia propagation is difficult due to seed sterility and small size plant, respectively. To evaluate shoot proliferation, in vitro-established estevia shoots were cultured in ½ MS with five (0.0, 2.22, 4.44, 8.88 and 17.6 µM) BAP levels. Thereafter, proliferated shoots were cultured on ½ MS with five NAA levels (0.0, 2.69, 5.37, 10.74 and 21.48 µM) to evaluate shoot rooting. Finally, non-rooted shoots, in vitro-rooted shoots and non-rooted shoots treated with a 0.4% NAA powder were transferred to ex vitro conditions. All experiments were distributed using a complete randomized design. The data indicated that BAP treated shoots showed a higher rate of shoot proliferation. An 87% of rooting and higher number of roots per explant was achieved with 10.74 µM of NAA. Non-rooted shoots transferred directly from Stage II showed the best survival rate.

Key words: Stevia, stevioside, micropropagation, plant growth regulator.


Introducción

Stevia rebaudiana (Asteraceae) es fuente de esteviósidos y rebaudiósidos, unos glucósidos de diterpenos no tóxicos y no mutagénicos usados comercialmente como edulcorantes naturales bajos en calorías y propicios para pacientes diabéticos ya que no aumentan los niveles de glucosa en la sangre (Kinghorn y Soejarto, 1986; Ishima y Katayama, 1976; Tanaka, 1982; Matsui et al., 1996; Brandle, 2000). La propagación sexual de estevia es difícil debido a los bajos porcentajes de germinación, dificultad para cosechar la semilla y los altos grados de variabilidad genética (Toffler y Orio, 1981). Alternativamente, el hábito de crecimiento y el tamaño limitado de la planta hacen la propagación por estacas lenta e ineficiente para producir grandes cantidades de plantas (Sakaguchi y Kan, 1992; Machado y Zaidan, 1995). La micropropagación ha mostrado ser un método que garantiza alta eficiencia y gran estabilidad genética en las plantas producidas; sin embargo, los estudios en producción masiva in vitro de plantas de estevia son limitados (Tamura et al., 1984; Bespalhok et al., 1992), y las publicaciones recientes enfatizan la necesidad de técnicas para la producción in vitro de los esteviosidos y rebaudiosidos (Akita et al., 1994; Bondarev et al., 2001; Bondarev et al., 2003) o incremento del material vegetativo vía organogénesis (Bondarev et al., 2003; Jain et al., 2009). El presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar un método eficiente para producir masivamente plantas de estevia en condiciones in vitro mediante el cultivo de explantes con meristemos pre-existentes.

Materiales y métodos

Material vegetativo

Los explantes fueron colectados a partir de plantas de estevia variedad Morita I de aproximadamente dos meses de edad y en estado de desarrollo vegetativo plantadas en la Granja Experimental de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Córdoba, Montería - Colombia (8° 52" LN y 76° 48" LO). Las plantas fueron mantenidas en eras alzadas con incidencia controlada de luminosidad (polisombra del 50%) y riegos diarios por aspersión.

Establecimiento y multiplicación

Los explantes, consistentes de segmentos de tallos con un par de yemas axilares (1.0 - 2.0 cm), fueron trasladados al Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Córdoba (Montería - Colombia, 8° 52" LN y 76° 48" LO). Una vez enjuagados con agua potable por aproximadamente media hora, fueron desinfectados superficialmente con 1.25% hipoclorito de sodio por 15 minutos, enjuagados tres veces con agua estéril y establecidos en medios de ½ (MS) Murashige y Skoog (1962) y suplementado (en mg L-1) con sacarosa (30,000), myo-inositol (100), tiamina HCl (0.4) y TC-agar (Sigma®) (6,000), con cambios a medio fresco de la misma formulación cada tres semanas.

Los explantes, de 1.0 a 1.5 cm de longitud, se establecieron in vitro en medio ½ MS adicionado con cinco concentraciones de benzilaminopurina (BAP) (0.0, 2.22, 4.44, 8.88 y 17.6 µM). Estos fueron incubados durante cuatro semanas, al final de los cuales se evaluaron las variables de respuesta; tasa de multiplicación (número de nuevos brotes por explante), longitud promedio de los brotes (mm) y el número de nuevas hojas por planta producidas.

Enraizamiento y aclimatización

Los tallos multiplicados fueron independientemente subcultivados durante cuatro semanas en ½ MS con cinco concentraciones (0.0, 2.69, 5.37, 10.74 y 21.48 µM) de ácido naftalenacético (ANA). Al final de período del cultivo se evaluó el porcentaje de enraizamiento, el número de raíces por tallo y la longitud promedio de raíces de cada tratamiento.

Los tallos enraizados in vitro y sin enraizar que se obtuvieron en la fase de multiplicación (sin tratamiento adicional o tratados con polvo enraizador al 0.4% de ANA en la base), fueron trasplantados en una mezcla de sustrato 1:1 (suelo:arena) contenida en bandejas plásticas de 30 alveolos cada una. Un total de 200 tallos por cada tratamiento fueron establecidos (600 unidades experimentales), los cuales fueron mantenidos cubiertos con una polisombra del 50% y con riego permanente durante ocho semanas, al final de las cuales se registró el número de plantas adaptadas a condiciones ex vitro.

Consideraciones generales

El pH de todos los medios fue ajustado a 5.7-5.8 previo a la adición del agar y esterilizado a 121 ºC y 1.1 kg-f cm-2 por 15 min. Los cultivos fueron mantenidos a 25 ºC, con 12 horas de luz diaria (40 µM m-2 s-1). Los tratamientos de los experimentos in vitro fueron distribuidos con un diseño completamente al azar con 15 repeticiones por tratamiento, cada repetición consistió de un explante establecido en un recipiente y cada experimento fue repetido una vez. Los datos fueron analizados con un análisis de varianza con base en el modelo estadístico Yij = μ + ai + εij, donde μ es el promedio general, ai fue el efecto de los reguladores BAP o ANA y εij el efecto del error experimental. Los promedios fueron separados con la prueba de Tukey (α = 0.05).

Resultados

Multiplicación

Los nuevos brotes crecieron a partir de los meristemos axilares presentes en los explantes (figura 1a y 1b). El análisis de varianza (Pr= 0.017) y la separación de medias muestra que la presencia de BAP en el medio de cultivo incrementa significativamente el número de nuevos brotes producidos por cada explante en comparación al tratamiento control, alcanzándose un promedio máximo de 5.5 nuevos brotes por cada explante cuando el medio 1/2 MS es adicionado con 8.8 µM de BAP (tabla 1). Con la variable longitud de brotes, existieron diferencias significativas entre los tratamientos con y sin fitohormona, siendo el tratamiento control donde la longitud de los brotes resultó significativamente mayor (Pr= 0.0014) comparado con aquellos desarrollados en los tratamientos suplementados con BAP (tabla 1). Con la variable número de hojas se encontraron diferencias significativas (Pr= 0.0150) entre tratamientos siendo la menor concentración (BAP 2,22 µM) la que registró un valor significativamente mayor con 30.30 hojas por vitroplanta producida. A mayor concentración de BAP se observa una disminución del número de hojas aunque para las concentraciones de 4.44 y 8.88 µM de BAP el nivel de significancia es igual.

Enraizamiento y aclimatización

El crecimiento de raíces adventicias ocurrió en todos los tratamientos (figura 1c); sin embargo, el mayor porcentaje de enraizamiento (87%) se registró en presencia de 10.74 µM de ANA (tabla 2). El ANOVA permitió detectar diferencias estadísticas (Pr< 0.001), mientras que la prueba de Tukey mostró que la presencia de 10.74 µM de ANA en el medio indujo el mayor número de raíces por tallo. Diferencias significativas fueron igualmente detectadas (Pr< 0.0001) con la variable longitud de raíces (tabla 2); sin embargo, las diferencias entre el tratamiento sin y con enraizador fueron mínimas, mostrando que el enraizamiento in vitro no fue necesario para la adaptación ex vitro de las plantas micropropagadas (figura 1d). El 67% de los tallos micropropagados sin enraizar y sin tratamiento exógeno con enraizador lograron adaptarse a condiciones ex vitro, seguido por los tallos enraizados in vitro (50% de supervivencia), mientras que solo el 33% de los tallos sin enraizar y tratados con 0.4% de ANA sobrevivieron.

Discusión

Se determinó una tasa de multiplicación de 5.5 nuevos brotes por explante con la concentración de 8.88 µM de BAP adicionado al medio de cultivo, lo cual representa un incremento en la tasa de multiplicación con una disminución en la concentración utilizada en estudios previos. Tamura et al., (1984) reportaron el desarrollo de uno a tres nuevos brotes por explante de las mismas características cultivados en presencia de 9.29 µM de kinetina y una tasa menor de multiplicación cuando la misma cantidad de kinetina fue utilizada en combinación con 1.07 µM de ANA. Un comportamiento similar en cuanto a disminución de la tasa de multiplicación fue observado con la interacción ANA y BAP utilizada para multiplicar brotes obtenidos a partir de explantes con meristemos pre-existentes (Suárez et al., 2006). Sivaran y Mukundan (2003), trabajando con la variedad Morita II, reportaron una mayor tasa de multiplicación en presencia de 4.44 o 8.88 µM de BAP registrando 6.3 y 8.5 nuevos brotes por explante, respectivamente, superando las tasas de multiplicación del presente estudio; sin embargo, en el actual estudio se registró una respuesta morfogenética más rápida obteniendo brotes de Stevia rebaudiana en menor tiempo. Bondarev et al. (2003) reportan que al comparar el efecto de 6.66 µM de BAP solo o en combinación con 8.05 µM de ANA en el medio de cultivo no se encontraron diferencias significativas; sin embargo, cuando se comparan estos tratamientos con el tratamiento control sin suministro de reguladores de crecimiento se obtiene un incremento de 1.5 veces en el número de nuevos brotes. Esto muestra que la interacción de ANA y BAP incide favorablemente no solo en el número de brotes/explante, sino también en el en el incremento del tamaño de los brotes producidos, lo cual contrasta con lo reportado por los resultados de Suárez et al. (2006) donde se observa una disminución significativa de la longitud de los tallos cuando BAP y ANA son combinados en el medio de cultivo. Anbazhagan et al. (2010) observaron una tasa de multiplicación de ocho nuevos tallos producidos a partir de explantes nodales con yemas axilares cultivados en un medio con 4,44 µM de BAP y 8.05 µM de ANA en un período de 40 días de cultivo. En la presente investigación se observó una disminución en la longitud de los tallos producidos en presencia de BAP, la cual se agudiza con el incremento de la dosis de esta fitohormona. Efectos similares fueron registrados por Bondarev et al. (2003) cuando adicionaron BAP en el medio.

Recientemente, Jain et al. (2009) reportaron incrementos significativos hasta de seis nuevos brotes caulinares a partir de explantes consistentes de hojas de estevia cuando estas fueron establecidas en medios suplidos con concentraciones de CuSO4 cinco veces por encima de la cantidad normal del medio MS. Estos resultados pueden considerarse en futuros estudios para incrementar las tasas de multiplicación a partir de explantes con meristemos pre-existentes.

Similarmente a lo observado en la presente investigación, reportes anteriores muestran poca correlación con respecto a los efectos de la presencia de BAP u otros reguladores sobre la producción de hojas in vitro de estevia (Sivaran y Mukundan, 2003; Bondarev et al., 2003).

De acuerdo con los resultados, un incremento en el suministro de ANA favorece un mejor enraizamiento de los brotes micropropagados. Esto contrasta con lo reportado por Bondarev et al. (2003) quienes no observaron diferencias en el enraizamiento in vitro de estevia con ANA. A diferencia de Sivaran y Mukundan (2003) quienes reportaron un 100% de enraizamiento y un promedio de 12 raíces por tallo con 4.9 µM de ácido indolbutírico (AIB), indicando que posiblemente el AIB tiene un mayor efecto auxínico sobre el enraizamiento in vitro de estevia. Los resultados obtenidos en la fase de adaptación de plantas a las condiciones ex vitro, permiten obviar el estado de enraizamiento in vitro, lo cual permitiría reducir significativamente los costos y los riesgos de pérdida de material in vitro, como lo refieren Martin et al. (2003 y Lara et al. (2003). Los resultados permiten estimar una producción aproximada de 4.5 x 106 nuevas plantas a partir de un solo explante en un año.

Agradecimientos

Los autores del presente trabajo expresan sus agradecimientos a la Universidad de Córdoba y a la División de Investigaciones por su apoyo en la realización del presente estudio.

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Cómo citar

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Suárez, I. y Quintero, I. R. (2014). Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes. Revista Colombiana de Biotecnología, 16(1), 29–33. https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.29420

ACM

[1]
Suárez, I. y Quintero, I.R. 2014. Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes. Revista Colombiana de Biotecnología. 16, 1 (ene. 2014), 29–33. DOI:https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.29420.

ACS

(1)
Suárez, I.; Quintero, I. R. Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes. Rev. colomb. biotecnol. 2014, 16, 29-33.

ABNT

SUÁREZ, I.; QUINTERO, I. R. Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes. Revista Colombiana de Biotecnología, [S. l.], v. 16, n. 1, p. 29–33, 2014. DOI: 10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.29420. Disponível em: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/29420. Acesso em: 29 mar. 2024.

Chicago

Suárez, Isidro, y Irma R. Quintero. 2014. «Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes». Revista Colombiana De Biotecnología 16 (1):29-33. https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.29420.

Harvard

Suárez, I. y Quintero, I. R. (2014) «Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes», Revista Colombiana de Biotecnología, 16(1), pp. 29–33. doi: 10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.29420.

IEEE

[1]
I. Suárez y I. R. Quintero, «Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes», Rev. colomb. biotecnol., vol. 16, n.º 1, pp. 29–33, ene. 2014.

MLA

Suárez, I., y I. R. Quintero. «Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes». Revista Colombiana de Biotecnología, vol. 16, n.º 1, enero de 2014, pp. 29-33, doi:10.15446/rev.colomb.biote.v16n1.29420.

Turabian

Suárez, Isidro, y Irma R. Quintero. «Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes». Revista Colombiana de Biotecnología 16, no. 1 (enero 1, 2014): 29–33. Accedido marzo 29, 2024. https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/29420.

Vancouver

1.
Suárez I, Quintero IR. Micropropagaión de Stevia rebaudiana Bertoni, un endulzante natural a través de explantes con meristemos pre existentes. Rev. colomb. biotecnol. [Internet]. 1 de enero de 2014 [citado 29 de marzo de 2024];16(1):29-33. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/29420

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