Marcadores RAPD para la identificación del sexo en papaya (<em>Carica papaya</em> L.) en Colombia

La determinación del sexo en plantas de papaya es considerado un sistema intrigante, debido a que esta especie presenta tres sexos (macho, hembra y hermafrodita) determinados por un locus multialélico. Además, esta especie no presenta cromosomas sexuales morfológicamente diferenciables. Los marcadores moleculares pueden asociarse a características de interés, como en el presente caso, al sexo en plántulas de papaya. Con el objetivo de identificar marcadores moleculares que permitan una rápida identificación del sexo en genotipos colombianos de plántulas de papaya, se aplicó la técnica RAPD (ampliación aleatoria de polimorfismos del ADN). El estudio encontró tres marcadores RAPD polimórficos, los cuales permitieron diferenciar los sexos de la papaya. Dos marcadores fueron específicos para plantas macho y hermafrodita, y un tercero para plantas hembra. Estos nuevos marcadores moleculares podrán ser beneficiosos en la determinación del sexo en genotipos colombianos de papaya.

 

FITOMEJORAMIENTO, RECURSOS GENÉTICOS Y BIOLOGÍA MOLECULAR

  Marcadores RAPD para la identificación del sexo en papaya (Carica papaya L.) en Colombia   RAPD markers for sex identification in papaya (Carica papaya L.) in Colombia  

Giovanni Chaves-Bedoya^{1, 2}, Mauricio Pulido¹, Erika Sánchez-Betancourt¹ y Víctor Núñez¹

1 Laboratorio de Genética Molecular Vegetal, Centro de Biotecnología y Bioindustria, Centro de investigación Tibaitatá, Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Corpoica), Mosquera (Colombia).
2 Autor de correspondencia. gchavesb@unal.edu.co

Fecha de recepción: 13 de diciembre de 2008. Aceptado para publicación: 2 de julio de 2009

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RESUMEN

La determinación del sexo en plantas de papaya es considerado un sistema intrigante, debido a que esta especie presenta tres sexos (macho, hembra y hermafrodita) determinados por un locus multialélico. Además, esta especie no presenta cromosomas sexuales morfológicamente diferenciables. Los marcadores moleculares pueden asociarse a características de interés, como en el presente caso, al sexo en plántulas de papaya. Con el objetivo de identificar marcadores moleculares que permitan una rápida identificación del sexo en genotipos colombianos de plántulas de papaya, se aplicó la técnica de RAPD (amplificación aleatoria de polimorfismos del ADN). El estudio encontró tres marcadores RAPD polimórficos, los cuales permitieron diferenciar los sexos de la papaya. Dos marcadores fueron específicos para plantas macho y hermafrodita, y un tercero para plantas hembra. Estos nuevos marcadores moleculares podrán ser beneficiosos en la determinación del sexo en genotipos colombianos de papaya.

Palabras clave: Carica papaya, plantas dioicas, determinación sexual.

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ABSTRACT

Sex definition in papaya is considered an intriguing system, due to the fact that the plant presents three different sexes (male, female and hermaphrodite), which are determined on a multiallelic locus. Moreover, the plant does not have morphologically differentiated sexual chromosomes. Provided that molecular markers can be associated to traits of interest, in the present study they were applied to rapid sex identification in seedlings of Colombian papaya genotypes. With the aim of finding such markers, an RAPD technique (Randomly Amplified Polymorphic DNA) was applied. The study allowed identifying three polymorphic RAPD markers apt for differentiating the sexes in papaya. Two of them are specific for male and hermaphrodite plants, and one for female plants. These novel molecular markers will be valuable for sex determination in Colombian genotypes of papaya.

Key words: Carica papaya, dioecious plants, sexual determination.

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Introducción

La papaya es una planta dicotiledónea, polígama diploide (Parasnis et al., 1999; Ming et al., 2001; Kim et al., 2002; Urasaki et al., 2002; Liu et al., 2004) que pertenece a la familia Caricaceae, género Carica (Badillo, 2002). El germoplasma de papaya presenta una considerable variación fenotípica para la mayoría de los rasgos hortícolas importantes, incluyendo tamaño, forma, color, contenido de azúcar y sabor del fruto, entre otros (Kim et al., 2002; Oliveira et al., 2007). La posibilidad de transformación genética, la eficiencia de los cruzamientos, la producción de abundante descendencia y la continua floración a lo largo del año hacen de la papaya un modelo atractivo para investigación genética y genómica (Ming et al., 2001).

En Colombia, el cultivo de la papaya se encuentra en el octavo lugar por área sembrada respecto a otras frutas cultivadas, siendo un fruto económicamente importante. La papaya proporciona frutos y látex económicamente valiosos en las áreas tropicales y subtropicales (Ming et al., 2001; Urasaki et al., 2002). Por ejemplo, la papaína, una enzima proteolítica abundante en el látex lechoso de los frutos, se usa en la industria alimenticia y textilera para suavizar la lana, la seda, y en la industria de perfumería (Villegas, 1997; Urasaki et al., 2002). Además, la planta de papaya es importante por sus tallos, hojas y raíces los cuales son empleados en un amplio rango de aplicaciones en la medicina popular (Ming et al., 2001).

La presencia de las tres formas sexuales -macho, hembra y hermafrodita- en esta especie ofrece varias ventajas para estudios genéticos y evolutivos. Posee un genoma pequeño de 372 megabases (Mb), contenido en nueve pares de cromosomas, un tiempo corto de floración de 9 a 15 meses, numerosos tipos de flores y un intrigante sistema de determinación sexual, por lo que su diferenciación ha sido tema frecuente de análisis genéticos. La papaya posee un cromosoma Y primitivo, con una región macho específica, que corresponde aproximadamente al 10% del cromosoma, pero que ha pasado por una severa supresión de recombinación y degeneración de la secuencia de ADN (Liu et al., 2004).

Storey (1953) concluyó que el sexo en papaya es determinado por un gen simple con tres alelos: M, macho; M^h, hermafrodita; y m, hembra. Las hembras (mm) son homocigotas recesivas. Los machos (Mm) y hermafroditas (M^hm) son heterocigotos, típicamente con el 25% de semillas no viables en sus frutos, porque cada combinación de los alelos dominantes (MM , MM^h o M^hM^h) es embriogénicamente letal (Parasnis, 1999; Ming et al., 2001; Urasaki et al., 2002; Liu et al., 2004). Posteriormente se sugirió que M y M^h representan regiones genéticamente inactivas de los cromosomas sexuales en las cuales genes vitales se perdieron (Liu et al., 2004)

Estudios citológicos para la identificación de cromosomas sexuales heteromórficos en papaya no han sido exitosos (Parasnis et al., 1999; Viskot y Hobza, 2004; Ming et al., 2007). Estos estudios sugieren que los cromosomas X y Y de papaya son morfológicamente homólogos a los autosomas. Lo anterior sugiere que los cromosomas están en etapas iniciales de diferenciación, en comparación con otras especies vegetales, también de naturaleza dioica, como es el caso de Silene latifolia, donde se encuentran cromosomas sexuales heteromórficos perfectamente diferenciados (Farbos et al., 1999; Filatov et al., 2000; Atanassov et al., 2001; Filatov et al., 2001).

De otra parte, la investigación molecular ha permitido encontrar resultados positivos en la identificación de diferentes tipos de marcadores, incluyendo SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) (Parasnis et al., 2000; Deputy et al., 2002; Urasaki et al., 2002; Chaves-Bedoya y Núñez, 2007), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Deputy et al., 2002; Urasaki et al., 2002), microsatélites (Parasnis et al., 1999) y AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) capaces de discriminar sexo en plantas de papaya; estos se pueden utilizar para la pronta determinación del sexo de papaya. La ausencia de falsos positivos y falsos negativos sexuales de acuerdo con el genotipo es un factor predominante para la elección de la adecuada selección de los marcadores moleculares, incluso en la fase de plántula. Esto se hace más significativo al considerar los híbridos de diferentes grupos, con una amplia diversidad genética.

La aplicación de marcadores RAPD para la identificación del sexo de papaya en estado juvenil puede facilitar enormemente el manejo del cultivo y el mejoramiento de la producción, mediante la ganancia en tiempo, espacio y costos, que de otra manera se requieren en el crecimiento de plantas de sexo indeseado.

Si el sexo de las plantas dioicas de papaya se identifica en estado de plántula, permitiendo obtener antes del trasplante a campo la proporción adecuada de plantas con el sexo deseado, se pueden ahorrar recursos como suelo, fertilizantes y agua, pudiendo ser dedicados al manejo del cultivo de solo plantas hembra o solo plantas hermafroditas (Chaves-Bedoya y Núñez, 2007). Una planta hembra de papaya produce alrededor de 100 frutos en su ciclo de vida y cerca de 250 g de papaína cruda por año. En plantaciones derivadas de semillas en donde aún existen machos, un incremento en el número de árboles de papaya hembra y hermafroditas por hectárea de terreno puede incrementar directamente la producción de frutos y papaína, haciendo este cultivo más rentable.

Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue identificar marcadores moleculares RAPD para diferenciar el sexo en plantas de papaya como base para la aplicación práctica en plantaciones comerciales.

En este trabajo reportamos tres nuevos marcadores RAPD, capaces de discriminar de manera reproducible el sexo en plantas colombianas de papaya.

   

Materiales y metodos

Material vegetal y extracción de ADN genómico
El material vegetal usado en el estudio fue colectado en el año 2004. Este fue obtenido del Centro de Investigación Corpoica, La Libertad, ubicado en Villavicencio, departamento del Meta (Colombia). Lo constituyen los cultivares de papaya Catira desarrollada por Corpoica y las accesiones ILS 647 y ILS 649. El ADN genómico fue extraído de hojas jóvenes usando el método estándar de CTA B con modificaciones menores (Chaves-Bedoya y Núñez, 2007).

Amplificación PCR de los fragmentos sexuales específicos
La PCR para RAPDs (Williams et al., 1990) fue llevada a cabo para volúmenes de 25 μL que contenían 1,2 ng de ADN, 1 μM del primer OP-A1 (5' CAG CCCTT C 3'), OP-L1 (5' GG CATGA CCT 3') y OP-P11 (5' GTAGA CCCGT 3'), 1U taq polimerasa, 0,2 mM de dNTPs, 1X buffer de amplificación, 1,5 mM de MgCl₂. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador MJ Resaearch PT200, con una temperatura inicial de desnaturalización de 94°C por 60 s y 44 ciclos con un perfil térmico para cada ciclo de 94°C por 60 s, 36°C por 60 s, 72°C por 60 s; luego de esto, un ciclo de extensión final a 72°C por 120 s. Los productos de la PCR fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y visualizados en un documentador de geles, Hitachi®, luego de la tinción con bromuro de etidio (0,1 μg mL^-1). El tamaño de las bandas se determinó utilizando como patrón el marcador de 250pb (DNA ladder, Promega).

  

Resultados y discusión

Mediante el uso de primers decámeros de la serie Operon technologies seleccionados al azar se encontraron dos marcadores moleculares RAPDs que permiten discriminar plantas de papaya machos y hermafroditas de las hembras. Con los oligos OP-A1 y OP-L1 se pudo amplificar, de manera reproducible, una banda de 1050 y 850 pb, respectivamente, tanto en los materiales de papaya macho como hermafrodita (Figs. 1A y 1B).

A pesar de que la papaya posee cromosomas sexuales homomórficos, la región amplificada con los marcadores OP-A1 y OP-L1 podría estar localizada en una región cromosómica específica común para machos y hermafroditas, lo que podría indicar diferenciación cromosómica entre estos sexos (Urasaki et al., 2002). El resultado indicado en la Fig. 1 es consistente con el trabajo de Liu et al. (2004), en el que se reporta una región específica denominada MSY (Male Specific Region) con secuencia idéntica compartida por machos y hermafroditas (Vyskot y Hobza, 2004; Kazama y Matsunaga, 2008), sugiriendo así que estos dos sexos podrían compartir un haplotipo para esta región que difiere de las hembras. Además, estos dos sexos comparten, a nivel cromosómico, información para el cromosoma Y, ausente en hembras (Liu et al., 2004).

Por otro lado, el primer OP-P11 permitió discriminar plantas hembras de plantas machos y hermafroditas al amplificar una banda de 1.750 pb (Fig. 2). Esto podría sugerir que el OP-P11 estaría en una región específica para hembras, sobre el cromosoma X. Teniendo en cuenta que en los cultivos comerciales se manejan solamente plantas hembras y hermafroditas, y estas últimas son preferidas por su forma, sabor y facilidad de empaque, el empleo del primer OP-P11 sería de gran importancia para diferenciar estos dos tipos sexuales. Esta diferenciación puede apoyar el trabajo del agricultor al permitir discriminar el sexo de las plántulas, y por tanto sembrar solo plantas del sexo deseado, por ejemplo, plantas hermafroditas.

Los trabajos reportados por Gangopadhyay et al. (2007) utilizando marcadores ISS R, Deputy et al. (2002), Magdalita y Mercado (2003) y Sánchez-Betancourt y Núñez (2008), establecen que se han identificado marcadores ADN que discriminan el sexo en plantas de papaya hembras. En los estudios de Deputy et al. (2002) y Sánchez-Betancourt y Núñez (2008) se empleó el marcador SCAR T1. Este generó una banda en todos los sexos de papaya por lo que no se puede usar como discriminante de sexo, pero sí como un control positivo de amplificación. Puesto que el marcador molecular OP-P11 presenta una banda específica para hembras, se considera de gran importancia para la determinación temprana del sexo en plantas de papaya. La amplificación de este marcador en plantas de papaya hembra permite verificar que se cuenta con una muestra de este sexo y no con un falso positivo por ausencia de amplificación, como sucedería si solo se emplean los marcadores RAPDs OP-A1 y OP-L1.

Los tres marcadores moleculares RAPDs encontrados en este trabajo se pueden usar en la identificación del sexo de las plantas de papaya en vivero. Además, a partir de estos marcadores se pueden diseñar marcadores SCAR que permitan una identificación más confiable de los materiales en estudio, como se ha realizado en trabajos previos (Deputy et al., 2002; Macedo et al., 2002; Urasaki et al., 2002; Chaves- Bedoya y Núñez, 2007; Oliveira et al., 2007).

En la hipótesis de letalidad zigótica para la determinación de sexo en papaya (Storey, 1953), se propone un locus (Sexl) con tres alelos. De acuerdo con la hipótesis de Storey, los fragmentos amplificados con los primers OP-A1 y OP-L1 podrían estar localizados en el segmento cromosómico que incluye los alelos M y Mh de machos y hermafroditas, respectivamente, mientras la amplificación con el primer OP-P11 estaría sobre el alelo m de plantas hembras. Asimismo, Viskot y Hobza (2004) reportan similitud de secuencias de ADN entre la región MSY (Male Specific Region) de plantas macho y hermafroditas, en contraste con su divergencia de la correspondiente región ligada al X, por lo que se podría inferir que estos marcadores se ubican sobre estas regiones.

Por otra parte, luego de emplear los primers reportados por Urasaki et al. (2002) como discriminantes de sexo, los resultados de este trabajo no coincidieron con los presentados por esos autores (datos no mostrados). El hecho de utilizar primers de 20 nucleótidos, altamente específicos, podría sugerir diferencias a nivel genómico, por lo cual los materiales asiáticos no respondieron de la misma manera. A nivel fenotípico estas diferencias también podrían presentarse por la variabilidad en algunas características hortícolas como tamaño, forma, color, sabor y dulzura del fruto, estatura de la planta, estambres carpelodicos y aborto de carpelos. Además, los cultivares de papaya pueden ser líneas ginodioicas endogámicas, poblaciones dioicas autocruzadas u ocasionalmente clones (Kim et al., 2002).

Igualmente, estas diferencias se pueden deber a la acumulación de secuencias repetitivas, las cuales están involucradas en la evolución de los cromosomas sexuales (Ainswort, 2000; Shunsuke et al., 2002). Un arreglo de duplicaciones de secuencias ligadas al cromosoma Y y la existencia de familias de genes sobre este cromosoma han sido recientemente observadas en papaya. Aun así, no es claro si las secuencias duplicadas ligadas al cromosoma Y tienen un rol similar para mantener la función del cromosoma Y en las plantas como en los animales (Viskot y Hobza, 2004).

  

Conclusiones

Puesto que la sexualidad en papaya no puede ser diferenciada con anterioridad al inicio de la floración, el hallazgo de marcadores moleculares que permitan la determinación del sexo podría facilitar el cultivo selectivo de estas plantas. Aunque el uso de técnicas moleculares represente un costo directo para agricultores o propietarios de viveros comerciales, en procesos a gran escala se pueden reducir costos como inversión de recursos y tiempo que se destina al mantenimiento de plantas del sexo no deseado. Además, al momento de efectuar un trasplante en un cultivo se podría tomar la decisión sobre la relación deseada de hembras y hermafroditas en la plantación comercial.

Aunque existen reportes en los que se ha encontrado determinación temprana del sexo en papaya mediante técnicas moleculares (Parasnis et al., 1999; Deputy et al., 2002; Macedo Lemos et al., 2002; Urasaki et al., 2002), en el presente estudio se observó que los marcadores moleculares empleados para la diferenciación sexual en genotipos de papaya diferentes a los colombianos no permiten la discriminación en estos últimos, es decir, que la precisión de los marcadores es variable entre los genotipos. Con esto se infiere que los genotipos de papaya varían de una región a otra, posiblemente como consecuencia de la acumulación de secuencias repetitivas y duplicación de genes que resultan de la interacción del genoma con el ambiente.

Los nuevos marcadores RAPD OP-A1, OP-P11 y OP-L1 reportados en este trabajo mostraron la capacidad de discriminar invariablemente el sexo de genotipos colombianos de papaya.

    

Literatura citada

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