Publicado

2014-07-01

Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca

Silencing of genes envolved in starch biosynthesis in cassava

DOI:

https://doi.org/10.15446/acag.v63n3.40650

Palabras clave:

yuca, bioetanol, silenciamiento génico, almidón (es)
cassava, bioethanol, gene silencing, starch (en)

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Autores/as

  • Simon Cortes Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá
  • Jose David Cortes Cenicaña, Colombia
  • Janeth Ladino CIAT, Colombia
  • Paul Chavarriaga CIAT, Colombia
  • Camilo Ernesto López Carrascal Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá
La yuca (Manihot esculenta Crantz), por presentar gran cantidad de almidón en sus raíces almacenadoras, se constituye en una potencial materia prima para el mercado de agrocombustibles. En este proyecto se buscó aprovechar la estrategia del silenciamiento génico mediado por ARN de interferencia (ARNi), para silenciar algunos de los genes de la ruta de biosíntesis del almidón y así obtener variedades con contenidos y estructura de almidón diferentes. Los genes que codifican para GBSS, SBE y AGPasa se amplificaron y clonaron en el vector binario de silenciamiento pHELLSGATE. Estas construcciones fueron empleadas para transformar Callo Embriogénico Friable (CEF) de yuca de la variedad 60444. Tras varios experimentos de transformación se lograron obtener dos líneas transgénicas correspondientes a la construcción pHELLSGATE:SBE las cuales fueron confirmadas. Estas plantas presentaron problemas de crecimiento y deformaciones en las hojas. Estos resultados parecen sugerir que el silenciamiento de los genes implicados en la biosíntesis de almidón compromete la viabilidad de las plantas de yuca.
Cassava (Manihot esculenta Crantz), due to its starchy roots is a potential raw material for the biofuel market. To modify the starch quality/quantity in cassava, we used RNA interference (RNAi) to silence selected genes of the starch biosynthesis pathway in the roots. Genes coding for GBSS, SBE & AGPasa were PCR-amplified and cloned into the silencing vector pHELLSGATE. The constructs were introduced in cassava cultivar 60444 by cocultivating Friable Embryogenic Callus (FEC) with Agrobacterium. After several transformation attempts, only two lines of plants were confirmed by Southern blot as transgenics for construct pHELLSGATE::SBE. These lines showed abnormal growth and deformed leaves. These findings suggested that silencing genes of the biosynthesis pathway in cassava may compromise the viability of plants.

Biotecnología


Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca

Silencing of genes envolved in starch biosynthesis in cassava

Simón Cortés1, José David Cortés1, Janeth Julieta Ladino2, Paul Chavarriaga2 y Camilo López1*

1Grupo Manihot Biotec, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá. 2Transformación Genética, Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT, Colombia. *Autor para correspondencia: celopezc@unal.edu.co

Rec.: 03.11.2013 Acep.:10.05.2014

Resumen

La yuca (Manihot esculenta Crantz) presenta un alto contenido de almidón en sus raíces almacenadoras, por lo que es una potencial materia prima para el mercado de agro–combustibles. En este proyecto se aprovecha la estrategia del silenciamiento génico mediado por ARN de interferencia (ARNi), para silenciar algunos de los genes de la ruta de biosíntesis del almidón y así obtener variedades con contenidos y estructura de almidón diferentes. Los genes que codifican para GBSS, SBE y AGPasa se amplificaron y clonaron en el vector binario de silenciamiento pHELLSGATE. Estas construcciones fueron empleadas para transformar Callo Embriogénico Friable (CEF) de yuca de la variedad 60444. Se obtuvieron dos líneas transgénicas correspondientes a la construcción pHELLSGATE:SBE las que fueron confirmadas. Estas plantas presentaron problemas de crecimiento y deformaciones en las hojas. Los resultados parecen sugerir que el silenciamiento de los genes implicados en la biosíntesis de almidón compromete la viabilidad de las plantas de yuca.

Palabras clave: yuca, bioetanol, silenciamiento génico, almidón.

Abstract

Cassava (Manihot esculenta Crantz), due to its starchy roots is a potential raw material for the biofuel market. To modify the starch quality/quantity in cassava, we used RNA interference (RNAi) to silence selected genes of the starch biosynthesis pathway in the roots. Genes coding for GBSS, SBE & AGPasa were PCR–amplified and cloned into the silencing vector pHELLSGATE. The constructs were introduced in cassava cultivar 60444 by cocultivating Friable Embryogenic Callus (FEC) with Agrobacterium. After several transformation attempts, only two lines of plants were confirmed by Southern blot as transgenics for construct pHELLSGATE::SBE. These lines showed abnormal growth and deformed leaves. These findings suggested that silencing genes of the biosynthesis pathway in cassava may compromise the viability of plants.

Key words: cassava, bioethanol, gene silencing, starch

Introducción

El desarrollo industrial ha dependido en gran medida de la explotación y uso de combustibles fósiles (Lincoln, 2005). La utilización del petróleo ha generado un incremento en la emisión de gases contaminantes que contribuyen al efecto invernadero y al cambio climático (Fantazzini et al., 2011). Entre las alternativas al empleo del combustible fósil se encuentran los biocombustibles líquidos tales como el etanol. El alcohol etílico o etanol se puede obtener por medio de tratamientos físicos, químicos y biológicos, partiendo de materias primas ricas en sacarosa, almidón o más recientemente empleando compuestos ricos en celulosa (Lin y Tanaka, 2006). Entre los productos con alto contenido de almidón se cuentan el maíz, el trigo, la papa y la yuca (Cardona y Sánchez, 2007). El almidón es una materia prima para la producción de bioetanol por medio de la liberación previa de los monómeros de glucosa. El alto porcentaje de almidón almacenado en las raíces de yuca hace que este cultivo tenga un gran potencial para la producción de bioetanol (Nguyen et al., 2007).

El almidón se compone de los polisacáridos amilosa y amilopectina, los cuales representan entre 98% y 99% del peso seco del gránulo de almidón (Mutisya et al., 2003). La amilosa está formada por cadenas lineales de 100 a 10,000 residuos glucosil unidos por enlaces α–1,4; mientras que la amilopectina lo está por cadenas cortas unidas por enlaces α–1,4, y adicionalmente presenta enlaces α–1,6 responsables de los puntos de ramificación (Cardona y Sánchez, 2007; Mutisya et al., 2003). La amilosa puede representar entre 14% y 24%, mientras que la amilopectina representa entre 70% y 80% (Mutisya et al., 2003).

La biosíntesis de los polisacáridos, amilosa y amilopectina, implica pocos pasos enzimáticos. La primera enzima que actúa en el amiloplasto es la adenosina difosfato glucosa pirofosforilasa (AGPasa), la cual partiendo de ATP y glucosa–1–fosfato genera ADP–glucosa, que es el sustrato a partir del cual se sintetizan los dos polisacáridos (Zeeman et al., 2010). La enzima sintasa de almidón ligada al gránulo de almidón (GBSS, por sus siglas en inglés: Granule Bound Starch Synthase), cataliza la síntesis de amilosa por medio de uniones α–1,4 (Baguma et al., 2003). La amilopectina se sintetiza por medio de la acción de la enzima ramificadora de almidón (SBE, por sus siglas en inglés: Starch Branching Enzyme), la cual introduce puntos de ramificación sobre las cadenas lineales por medio de uniones α–1–6. (Baguma et al., 2003). Adicionalmente a la SBE, las sintasas de almidón solubles (SSS, por sus siglas en inglés Soluble Starch Synthase), participan en la formación de amilopectina (Zeeman et al., 2010) (Figura 1).

El limitante en el uso del almidón para la producción de bioetanol radica en que se requiere el empleo de enzimas que permitan su hidrólisis para generar azúcares fermentables (Schubert, 2006). Una solución al problema es la modificación de la estructura y composición del almidón, haciéndolo menos complejo, con menor proporción de los polímeros constitutivos y mayor cantidad de azúcares libres. Una alternativa para lograr este tipo de almidones es a través del silenciamiento génico de los genes que codifican para las enzimas implicadas en la biosíntesis de almidón. En este trabajo se exploró la posibilidad de emplear la tecnología de ARN de interferencia para inactivar los genes codificantes para la AGPasa, la GBSS y la SBE en la variedad de yuca 60444.

Materiales y métodos

Diseño de cebadores

Para el diseño de los cebadores correspondientes a la AGPasa se empleó la secuencia de nucleótidos de un EST reportado en el Genbank (número de accesión DB927992) mientras que para GBSS se utilizó la secuencia de nucleótidos reportada para yuca (número de accesión X74160). Finalmente la secuencia del gen SBE reportada para yuca (número de accesión X77012.19) fue utilizada para el diseño de los cebadores. Los cebadores fueron diseñados empleando el programa primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). La secuencia CACC fue adicionada en el extremo 5' del primer sentido para permitir la clonación en el vector de entrada del sistema Gateway (Cuadro 1).

Extracción de ADN, ARN y síntesis de ADNc

La extracción de ADN se realizó a partir de la variedad 60444 con uso del protocolo descrito por Dellaporta et al. (1983). El ARN fue extraído a partir de hojas y tallos de plantas de la misma variedad mantenidas en invernadero según el protocolo descrito por Beltrán et al. (2010). La integridad del ARN se verificó en gel de agarosa a 1% y se cuantificó con el espectrofotómetro Nanodrop 2000 Termo Scientific®. Previo a la realización de la síntesis de ADNc se realizó tratamiento con ADNasa I (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La síntesis de primera cadena de ADNc se hizo con el kit First Strand ADNc synthesis (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) según las instrucciones del fabricante.

Amplificación y clonación

La amplificación por PCR se realizó sobre ADN o ADNc de la variedad TMS60444. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen de 50 µL, conteniendo 50–100ng de ADN, MgCl2 2.5mM, 0.2mM de dNTPs, 0.1µM de cada primer, 1 U de Taq polimerasa y Buffer 1X (KCl 50mM, Tris–HCl pH 8.8 10mM, Triton X–100 0,1%). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en el termociclador BIORAD MyCyclerTM donde se programaron los siguientes cuatro pasos. Primero, denaturación a 94 °C por 2 min; segundo, 35 repeticiones de las temperaturas siguientes: 94 °C 30 seg, 60 °C por 30 seg, 72 °C 1 min; tercero, a 72 °C por 5 min; último, 20 °C por 5 min. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.2%. Los fragmentos de PCR se eluyeron empleando el Kit Gel Extraction de QIAGEN y se clonaron en el vector pENTR/D–TOPO, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Posterior a la reacción de clonación, se llevó a cabo la transformación de células E. coli, por medio de choque térmico. Se platearon 200 µL de bacterias en cajas de petri con medio LB (1.0% Triptona 0.5% Extracto de levadura 1.0% Cloruro de sodio) selectivo con el antibiótico Kanamicina a una concentración de 50 µg/ml. Las células crecieron toda la noche a una temperatura de 37 °C. Las colonias positivas se confirmaron por PCR en las condiciones descritas previamente y se realizó la extracción de ADN plasmídico por medio del kit GeneJT Plasmid Miniprep (Fermentas). A partir de los clones positivos se realizó la secuenciación. Una vez confirmada la correcta clonación de los fragmentos se procedió a transferirlos al vector pHELLSGATE 12, mediante la reacción LR siguiendo las instrucciones del fabricante (Life Technologies). Posterior a la reacción de recombinación se procedió a la transformación de células de E. coli DH5α mediante electroporación. Las bacterias se cultivaron en cajas petri con medio LB más Spectinomicina ( 50 µ g/ml). L as c olonias positivas fueron confirmadas por PCR y secuenciación. Adicionalmente se hizó una digestión del vector pHELLSGATE con las enzimas XhoI y XbaI, las cuales liberan los fragmentos en sentido y antisentido. Para las digestiones se emplearon 800 ng del vector pHELLSGATE 20 Unidades de XbaI y 10 Unidades de XhoI según las instrucciones del fabricante (Fermentas).

Producción de callo embriogénico friable

El callo embriogénico friable (CEF) se obtuvo a partir de la variedad de yuca 60444. Se realizó una propagación in vitro empleando segmentos nodales de plantas crecidas en medio 4E (sales Murashige y Skoog (MS), sacarosa 2%, Tiamina 1 ppm, Mio–inositol 100ppm, CuSO4 2 µM, ANA 0.02 ppm, GA3 0.05 ppm y BAP 0.04 ppm), a 28°C con fotoperíodo 12h/12h por 45 días en una incubadora Sanyo MLR 350. La embriogénesis primaria se hizo a partir de yemas axilares en medio líquido MS250pi (MS suplementado con vitaminas B5 de Gamborg, sacarosa 2%, CuSO4 2µM, caseína hidrolizada 50 mg/lt y picloram 12 mg/lt), mientras que la embriogénesis cíclica se llevó a cabo en medio MS250pi gelificado con gelrite 0.2%. Los embriones obtenidos se incubaron por 30 días a 28 °C en oscuridad. Para la inducción del CEF se aislaron embriones globulares que fueron transferidos a medio GD250pi (Sales Greshoff y Doy (GD)), Vitaminas GD 1X, Sacarosa 2%, picloram 50µM, Agar 0.6%) (Bull et al., 2009). A partir de los clústers celulares obtenidos se llevó a cabo el aislamiento de CEF en medio GD250pi y se renovó el medio a los 22 días. El CEF aislado se incubó a 28 °C con un fotoperiodo 12/12.

Transformación genética

Las construcciones genéticas en pHELLSGATE fueron introducidas en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación, con protocolos descritos previamente (Bull et al., 2009). Las bacterias positivas se aislaron y se confirmó la presencia del vector mediante extracción de ADN plasmídico empleando el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Fermentas). La colonia de Agrobacterium seleccionada se cultivó en medio LB en oscuridad hasta alcanzar una densidad óptica DO600nm 0.4, momento en el cual se realizó una pre–inducción con acetosiringona (AS) hasta alcanzar una DO600nm entre 0.8 y 1.0. El cultivo se centrifugó para resuspenderlo en medio GDS (Beltrán et al., 2010) + acetosiringona 100 µM. Este cultivo fue empleado en las transformaciones de CEF obtenido previamente. El CEF se organizó en placas de GDS + acetosiringona 100µM. A cada clúster de CEF se le adicionaron 20 µl de bacteria y se incubó a 22 °C por 3 días en oscuridad, como se describe en Beltrán et al. (2010). Para los procedimientos de lavados, transferencia de CEF y de regeneración se realizaron siguiendo el protocolo descrito por Beltrán et al. (2010). Los embriones somáticos obtenidos fueron aislados en medio MBI suplementado con cefo500 y geneticina para estimular su crecimiento. Posteriormente los embriones más grandes se transfirieron a medio MS2–CA (Sales MS, Vitaminas MS, sacarosa 2% y carbón activado 0.5%) para estimular su germinación. Las plantas obtenidas se crecieron en medio 17N (1/3 sales MS, Vitaminas MS, ANA 0.01 mg/lt y GA3 0.01 mg/lt)) para estimular el enraizamiento.

Caracterización molecular de las plantas transgénicas

El ADN de las plantas transgénicas se extrajo a partir de plantas in vitro siguiendo la metodología propuesta por Dellaporta et al (1983). Las reacciones de PCR se desarrollaron como se describió previamente con la diferencia que se emplearon los cebadores correspondientes al gen nptII (NPTIIsmallF 5'–CCTGCTTGCCGAATATCATGGTGG–3' y NPTIIsmallR 5'–CGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGG–3'). Para el southern blot se digirieron aproximadamente 12.5 µg de ADN con la enzima de restricción EcoRI a 5 U/µg de ADN. La digestión se corrió en un gel de agarosa al 0.8% a 75 V por 4 horas. El protocolo para la realización del montaje y la transferencia se cumplio de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Roche Molecular Biochemical DIG application manual for filter hybridization). La sonda se sintetizó con los cebadores para el gen nptII y marcó con empleo de digoxigenina siguiendo el kit DIG PCR probe synthesis kit (Roche, Mannheim, Germany). La hibridación y detección de la luminiscencia se realizó con el kit DIG Luminescent Detection KIT (Roche, Mannheim, Germany) según con las recomendaciones del fabricante (Roche, 2000).

Resultados

Elaboración de las construcciones para ARNi

Debido a que el gen correspondiente a AGPasa presenta un intrón de gran tamaño fue necesario clonarlo empleando ADNc. El fragmento del gen que codifica para la subunidad grande de la AGPasa fue exitosamente amplificado empleando los cebadores diseñados (Figura 3A). Con los cebadores para GBSS se logró amplificar un fragmento de 300 pb (Figura 4A). Finalmente un fragmento de 350 pb fue obtenido del gen SBE (Figura 5A). En este último caso se presentó una amplificación en el control negativo. Hubo varios ensayos con miras a eliminar esta contaminación (cambio de reactivos, incluidas nuevas diluciones de primers) con resultados negativos. Sin embargo la posterior secuenciación de los productos de PCR permitió confirmar la correcta identidad del gen (ver más adelante). En cada caso, los productos de PCR se eluyeron y clonaron en el vector pENTR/D–TOPO, obteniendo un alto número de colonias recombinantes, a partir de las cuales se confirmó la correcta clonación de los insertos (Figura 3B, Figura 3C; Figura 4B, Figura 4C y Figura 5B, Figura 5C). Las secuencias obtenidas a partir de los clones permitieron identificar que los genes clonados correspondían a los genes cassava4.1_005507m.g, cassava4.1_003884m.g y cassava4.1_001595m.g del genoma de yuca (www.phytozome.com) los cuales han sido anotados como AGPasa, GBSS y SBE respectivamente. A partir de los clones positivos obtenidos se logró la transferencia exitosa de los fragmentos correspondientes a cada gen en el vector pHELLSGATE12 (Figura 2). Para confirmar la clonación de los fragmentos de los genes en sentido y anti–sentido, se llevó a cabo una digestión de las construcciones con las enzimas XhoI y XbaI, las cuales permiten liberar el inserto clonado en sentido y antisentido respectivamente. En todos los casos se observaron las bandas correspondientes esperadas (Figura 3D, Figura 4D y Figura 5D). El PCR realizado empleando las bandas eluidas permitieron confirmar la presencia de cada uno de los genes (Figura 3E, Figura 4E y Figura 5E). Se generaron así tres construcciones independientes: pHELLSGATE:AGPasa, pHELLSGATE:GBSS y pHELLSGATE:SBE, las cuales fueron confirmadas por secuenciación.

 

Transformación genética

El CEF obtenido fue transformado con cada una de las construcciones. Se realizaron en total 19 ensayos de transformación para cada una de las tres construcciones. En algunos casos se obtuvieron embriones después de varios períodos de selección. Sin embargo, en la mayoría de las construcciones estos embriones no continuaron su desarrollo. Para los embriones obtenidos con las construcciones pHELLSGATE:AGPasa y pHELLSGATE:GBSS no se logró obtener plantas regenerantes. A partir de los embriones transformados con la construcción pHELLSGATE:SBE se lograron regenerar ocho plantas. De las evaluadas, dos mostraron una amplificación positiva del gen nptII (Figura 6). Las plantas restantes corresponden a escapes. Las dos plantas positivas se multiplicaron, pero presentaron un crecimiento lento. Finalmente los experimentos de Southern blot con empleo de una sonda correspondiente al gen nptII indicaron que las dos plantas fueron producidas a partir de eventos independientes de transformación por tener un patrón de bandas diferente (Figura 7). Las dos plantas obtenidas presentaron fenotipos anormales, con hojas curvadas, sin expandirse y de crecimiento muy lento, lo que no permitió su adaptación a suelo y condiciones de invernadero, por lo cual no se pudo realizar una caracterización fenotípica y de contenido y tipo de almidón.

Discusión

Las materias primas vegetales ricas en almidón son una opción para la producción de bioetanol (Smith, 2008). Sin embargo, los costos asociados con la fragmentación del almidón para realizar la fermentación de los azúcares liberados hace que la producción de bioetanol a partir de almidón no sea competitiva (Schubert, 2006). La yuca es una raíz con altos contenidos de almidón y gran tolerancia a la sequía que puede crecer en suelos tóxicos para muchos cultivos (Sayre et al., 2011). En este trabajo se estudió la posibilidad de silenciar algunos de los genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca con el objetivo de generar variedades con mayor contenido de azúcares libres, lo que facilitaría la producción de bioetanol.

Se seleccionaron secuencias para los tres genes más importantes de la ruta de biosíntesis de almidón: AGPasa, GBSS y SBE. En el momento en que se inició este trabajo no estaba disponible la secuencia del genoma de yuca, por lo cual los cebadores se diseñaron a partir de las secuencias de ESTs disponibles. La amplificación y secuenciación de los insertos permitió confirmar la correcta amplificación e identidad de los genes, lo cual se comprobó con la liberación y anotación del genoma de yuca (www.phytozome.com).

Con el vector pHELLSGATE de silenciamiento, el cual es compatible con la tecnología Gateway (Helliwell y Waterhouse, 2003) fue posible obtener las tres construcciones pHELLSGATE:AGPasa, pHELLSGATE:GBSS y pHELLSGATE:SBE, que fueron empleadas en los experimentos de transformación.

Se realizaron varios ensayos de transformación de CEF de la variedad 60444, la cual presenta la mayor eficiencia de transformación entre múltiples variedades evaluadas. A pesar de varios ensayos de transformación no fue posible conseguir embriones o plantas regeneradas cuando se realizó la transformación con pHELLSGATE:AGPasa y pHELLSGATE:GBSS. Sólo fue posible obtener dos plantas transgénicas para la construcción pHELLSGATE:SBE y aun así, estas plantas presentaron fenotipos deformes y un crecimiento muy lento. Los resultados sugieren que el silenciamiento de estos genes puede comprometer la viabilidad de las plantas. Es muy posible que el silenciamiento así obtenido haya sido mucho más elevado que lo reportado, lo que ocasionó su inviabilidad. Sería interesante evaluar si las plantas regeneradas presentan silenciamiento a través de Northern blot para detectar posibles ARNs pequeños de interferencia.

Hay una familia relativamente grande para cada uno de los genes AGPasa, GBSS y SBE con miembros dentro de ellas que se expresan en condiciones y tejidos particulares (Cortés et al. (n.p.); Baguma et al., 2003). Es posible que el silenciamiento producido a partir de las construcciones en este ensayo dirijan el silenciamiento de varios miembros de la familia y comprometa seriamente la viabilidad de las plantas. En varios trabajos (Morandini, 2009; 2013; Patrick et al., 2013) se ha encontrado que la modificación en el metabolismo del azúcar puede tener efectos en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Plantas transgénicas de caña de azúcar donde se disminuyó la actividad de la invertasa neutral citosólica, si bien presentaron un aumento en la concentración de sucrosa, mostraron un vigor reducido (Rossow et al., 2010). El silenciamiento del gen que codifica para una invertasa vacuolar en melón incrementó la concentración de fructosa en el fruto, pero las plantas presentaron un crecimiento vegetativo disminuido y frutos más pequeños (Yu et al., 2008). La modificación de invertasas en papa (Bhaskar et al., 2010) y en plantas de Lotus (Welham et al., 2009), si bien ha permitido incrementar la concentración de sucrosa, en algunos casos se observa reducción en las raíces y en el crecimiento de meristemos (Welham et al., 2009). En relación con las sucrosas sintasas, no se han reportado trabajos en los que la modificación de este tipo de enzimas no ocasione un retardo en el crecimiento de las plantas (Patrick et al., 2013). En caña de azúcar y tabaco se encontró que la modificación genética para incrementar azucares como el sorbitol genera efectos negativos como reducción en biomasa, necrosis y senescencia temprana (Chong et al., 2009; Sheveleva et al, 2000). Los estudios sugieren que la modificación del metabolismo del azúcar puede comprometer el homeostasis celular, conllevando a efectos deletéreos como los que se pudieron presentar en las plantas de yuca silenciadas en algunos genes de la ruta de almidón. No obstante para el caso de yuca se han reportado variedades naturales con altos contenidos de azúcar con crecimiento y desarrollo normales (Carvalo et al., 2004; Souza et al., 2013).

Un mayor conocimiento de los patrones de expresión y funciones de las diferentes isoformas permitiría diseñar regiones blanco más específicas de cada uno de los genes para silenciar. De igual manera, la posibilidad de emplear las mismas construcciones pero con el control de promotores inducibles podría solucionar el problema de la baja viabilidad de las plantas.

Conclusiones

  • En este trabajo se pudo amplificar y clonar los genes que codifican para GBSS, SBE y AGPasa y se introdujeron en plantas de yuca por transformación genética.
  • Fue posible obtener dos líneas transgénicas de plantas silenciadas para el gen SBE, no obstante presentaron problemas de crecimiento y deformaciones en hojas.
  • Es posible que el silenciamiento de los genes de la ruta biosintética de almidón genere problemas en el desarrollo y crecimiento de plantas de yuca.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR) Contrato No 046–2007D7499–155–07 y por la DIB (No 9905).

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Cómo citar

APA

Cortes, S., Cortes, J. D., Ladino, J., Chavarriaga, P. y López Carrascal, C. E. (2014). Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca. Acta Agronómica, 63(3), 262–271. https://doi.org/10.15446/acag.v63n3.40650

ACM

[1]
Cortes, S., Cortes, J.D., Ladino, J., Chavarriaga, P. y López Carrascal, C.E. 2014. Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca. Acta Agronómica. 63, 3 (jul. 2014), 262–271. DOI:https://doi.org/10.15446/acag.v63n3.40650.

ACS

(1)
Cortes, S.; Cortes, J. D.; Ladino, J.; Chavarriaga, P.; López Carrascal, C. E. Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca. Acta Agron. 2014, 63, 262-271.

ABNT

CORTES, S.; CORTES, J. D.; LADINO, J.; CHAVARRIAGA, P.; LÓPEZ CARRASCAL, C. E. Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca. Acta Agronómica, [S. l.], v. 63, n. 3, p. 262–271, 2014. DOI: 10.15446/acag.v63n3.40650. Disponível em: https://revistas.unal.edu.co/index.php/acta_agronomica/article/view/40650. Acesso em: 28 mar. 2024.

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Cortes, Simon, Jose David Cortes, Janeth Ladino, Paul Chavarriaga, y Camilo Ernesto López Carrascal. 2014. «Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca». Acta Agronómica 63 (3):262-71. https://doi.org/10.15446/acag.v63n3.40650.

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Cortes, S., Cortes, J. D., Ladino, J., Chavarriaga, P. y López Carrascal, C. E. (2014) «Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca», Acta Agronómica, 63(3), pp. 262–271. doi: 10.15446/acag.v63n3.40650.

IEEE

[1]
S. Cortes, J. D. Cortes, J. Ladino, P. Chavarriaga, y C. E. López Carrascal, «Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca», Acta Agron., vol. 63, n.º 3, pp. 262–271, jul. 2014.

MLA

Cortes, S., J. D. Cortes, J. Ladino, P. Chavarriaga, y C. E. López Carrascal. «Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca». Acta Agronómica, vol. 63, n.º 3, julio de 2014, pp. 262-71, doi:10.15446/acag.v63n3.40650.

Turabian

Cortes, Simon, Jose David Cortes, Janeth Ladino, Paul Chavarriaga, y Camilo Ernesto López Carrascal. «Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca». Acta Agronómica 63, no. 3 (julio 1, 2014): 262–271. Accedido marzo 28, 2024. https://revistas.unal.edu.co/index.php/acta_agronomica/article/view/40650.

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1.
Cortes S, Cortes JD, Ladino J, Chavarriaga P, López Carrascal CE. Silenciamiento de genes de la ruta de biosíntesis de almidón en yuca. Acta Agron. [Internet]. 1 de julio de 2014 [citado 28 de marzo de 2024];63(3):262-71. Disponible en: https://revistas.unal.edu.co/index.php/acta_agronomica/article/view/40650

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